目的:通过建立幽门螺杆菌相关性胃炎(heli cob act erpylori associated gastritis,HAG)脾 胃 湿热证 的小 鼠模型,观察灭幽汤对Keap 1/Nrf2/ARE信号通路中相关蛋白和mRNA表达水平、氧化应激因子等指标的影响,以探究灭幽汤对HAG脾胃湿热证小鼠氧化应激的调控作用。方法:将28只SPF级BALB/c雄性小鼠,随机分成空白组(8只)、模型组(20只)。空白组在常规环境饲养,予以普通饲料自由饮食,模型组给予肥甘饲料自由饮食。同时,空白对照组用布式肉汤0.2selleckchemml/只灌胃,其余模型组用浓度为(1 ×109cfu/ml)的Hp活菌混悬液0.2ml/只灌胃,空白组与模型组均隔日灌胃 1次,共5次。接种后定植14selleckchem Puromycin天,定植期间,模型组继续给予肥甘饲料饲养,空白组予常规方式饲养。造模过程中肉眼观察各组动物的症状(纳呆,便溏或便秘,倦怠)、监测饮水量、饮食量,生存率,体重变化。在实验第3 1天(Hp定植1 4天后),空白组和造模组各随机挑选2只小鼠取胃组织进行快速尿素酶试验、Warthin-Starry银染、HE染色以进行模型鉴定。造模成功后,把模型组18只小鼠随机分为模型对照组(6只)、灭幽汤组(6只)、四联药物组(6只)。灭幽汤组予以灭幽汤(10ml/kg)灌胃,标准四联组予以标准四联混悬液(immediate recall10ml/kg)灌胃,空白组、模型对照组分别以等量蒸馏水灌胃。每只小鼠灌胃体积为10ml/kg,每日给药1次,共给药2周。末次给药后,所有小鼠禁食禁饮30min,而后处死小鼠,取其血清及胃组织标本送检。观察各组小鼠生存率、体重变化,饮食量,饮水量,活动状态、大便性状等情况;苏木素—伊红(HE)染色观察胃黏膜组织病理损伤情况;Elisa法检测血清IL-1 β、IL-18炎性因子的含量;生化检测血清氧化损伤因子丙二醛(MD A),氧化应激保护因子超氧化物歧化酶(SOD)含量;HE及Warthin-Starry银染观察胃黏膜炎症情况;Western-blot检测胃黏膜组织Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表达,RT-PCR检测胃组织中Keap1、Nrf2、HO-1的mRNA的表达变化。结果:1.小鼠一般情况观察:灭幽汤组小鼠、标准四联组小鼠与模型组相比,变化趋势较稳定,纳食、饮水量、精神均可,体重稳步上升,但饮水量绝对值较空白对照组稍低。模型对照组小鼠体重上升趋势最为缓慢,灭幽汤组、标准四联组小鼠接受治疗后体重均明显增加,其中标准四联组小鼠体重增加相对更快。2.W-S银染、快速尿素酶实验提示小鼠成功种植HP。3.HE染色:模型对照组胃粘膜病理损伤明显,而灭幽汤组、标准四联组小鼠胃粘膜炎症反应较模型组明显缓解。4.ELISA检测:空白对照组SOD偏高,而MDA偏低。和空白组相比,模型对照组SOD偏低,而MD A较高。(P<0.0 1);与模型对照组相比,灭幽汤组、标准四联组SOD含量显著增加,而MDA含量显著减少(P<0.01);但灭幽汤组的SOD含量略低于标准四联组(P<0.05),两组间MDA含量差异不显著(P>0.05)。5.PCR检测Keap1、Nrf2、HO-1mRNA的表达:空白对照组Keap1、Nrf2、HO-1mRNA的表达量较模型对照组高(P<0.0 1)。与模型对照组相比,标准四联组Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA表达均显著升高(P<0.01),灭幽汤组Keap1、Nrf2mRNA表达升高(P<0.05)HO-1mRNA表达显著升高(P<0.0 1);但灭幽汤与标准四联组比较,差异不具有统计学意义。(P>0.05)。6:Western-blot检测胃黏膜组织Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表达:四组HO-1蛋白表达量满足正态分布,但不满足方差齐性;采用KW检验,P=0.814>0.05,可认为四个组别之间的小鼠HO-1蛋白表达无明显差异;四组Nrf2蛋白满足正态分布且方差齐,F=0.858,P=0.483>0.05,可认为四组Nrf2蛋白表达无明显差异。四组Keap1蛋白满足正态分布但方差不齐,K-W检验示P=0.005<0.01,各组Keap1蛋白表达有明显差异,两两比较显示,空白对照组与模型对照组之间、灭幽汤组、四联组与模型对照组之间、灭幽汤组和标准四联组之间均无明显差异(P>0.05),灭幽汤组、标准四联组均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HP感染后可诱发小鼠氧化应激反应;灭幽汤能够改善HAG脾胃湿热证小鼠一般情况,从整体上缓解HAG小鼠症状;灭幽汤能提高HAG小鼠Keap1、Nrf2、HO-1mRNA和SOD的表达,降低氧化应激产物MD A的堆积;灭幽汤能通过调控Keap 1-Nrf2-ARE通路,进而抑制HAG脾胃湿热证小鼠氧化应激反应,改善其客观症状和理化指标,从而达到治疗HAG的目的,但本实验并未证实灭幽汤对Keap 1、Nrf2、HO-1蛋白表达进行了干预。