目的:肾虚湿瘀是糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)的主要病机之一,多年临床实践及实验研究证实,具有益肾活血清泄作用的糖肾康颗粒可明显延缓DKD疾病进程。近年研究发现,表观遗传学改变介导的足细胞损伤在DKD的发生及进展过程中发挥着重要作用。本研究围绕DKD从动物体内实验及细胞实验两方面展开研究。体内实验以db/db小鼠为DKD动物模型,观察db/db小鼠肾损伤指标、肾脏病理变化及细胞焦亡炎性因子Nod样受体蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、白介素-18(IL-18)、IL-1β的表达变化及糖肾康的干预作用;进一步通过体外实验进行验证,以条件永生化小鼠足细胞为模型,观察高糖对足细胞焦亡的影响及糖肾康的干预作用。同时,通过对肾小球足细胞敲减lnc RNA MALAT1,观察MALAT1对足细胞的影响及通过NLRP3-caspase-1-IL-1β/IL-18通路介导细胞焦亡的机制。进一步实验观察DNA甲基化对高糖诱导的足细胞焦亡的影响,并通过高通量甲基化捕获测序方法,筛选高糖诱导足细胞损伤过程中发生甲基化的基因,进一步结合双荧光素酶报告基因检测DNA甲基化转录因子Sp1与MALAT1的靶向关系,从表观遗传间的交互作用角度,探讨高糖诱导足细胞焦亡的机制及糖肾康的干预作用,从而为益肾活血清泄法干预DKD提供理论依据和实验支撑。方法:1.糖肾康颗粒通过干预细胞焦亡改善db/db小鼠肾损伤的机制研究:选择db/db小鼠作为DKD动物模型,设对照组、模型组、缬沙坦组及糖肾康组,观察糖肾康颗粒干预后db/db小鼠小鼠皮毛色泽、活动、精神状态、进食、饮水、尿量等一般情况,小鼠糖代谢情况,通过肾脏组织HE、PAS、Masson染色及透射电镜观察肾脏病理变化,通过生化分析或ELISA法检测肾损伤指标如尿白蛋白/肌酐(UACR)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys C)、β2微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG),Western Blot及免疫荧光检测db/db小鼠肾脏Nephrin表达情况,以及细胞焦亡炎性因子NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表达变化。2.MALAT1对高糖诱导的足细胞焦亡的影响及糖肾康的干预作用:采用30mmol/L葡萄糖培养基诱导足细胞48h建立足细胞损伤模型。制备糖肾康大鼠含药血清,并将含药血清设4个浓度梯度,采用MTT法筛选出糖肾康含药血清的最佳作用浓度。采用流式细胞仪检测糖肾康对高糖诱导的足细胞凋亡率的影响,收集各组细胞培养上清液,检测乳酸脱氢酶(LDH)水平,Western Blot法观察细胞焦亡炎性因子NLRP3、Caspase-1,ELISA法检测IL-18及IL-1β的表达变化。q PCR法检测高糖不用作用时间下MALAT1的m RNA表达水平,敲减MALAT1,Western Blot或ELISA法观察敲减MALAT1后NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表达变化。3.高糖诱导足细胞焦亡的DNA甲基化基因筛选验证及糖肾康的干预作用:采用DNA甲基化抑制剂5-Aza-Cd R干预足细胞模型,观察足细胞焦亡相关因子的表达情况。采用高通量甲基化捕获测序方法筛选高糖诱导足细胞损伤过程中发生甲基化的基因及经糖肾康干预后甲基化水平发生改变的基因,确定差异甲基化基因,同时使用PROMO网站预测MALAT1的可能转录因子,将这些转录因子从甲基化差异基因中筛选出来,进行q PCR验证,再筛选出表达水平较高且表达差异较大的转录因子Sp1。构建Sp1过表达质粒、MALgermline genetic variantsAT1启动子区野生型质粒及相应对照质粒并进行细胞转染,进一步通过双荧光素酶报告基因系统验证转录因子Sp1是否与MALAT1基因的启动子区相结合。最后采用q PCR法检测对照组、模型组、糖肾康组及5-Aza-Cd R组足细胞SP1、MALAT1m RNA表达水平,观察糖肾康通过影响DNA甲基化对Sp1及MALAT1的表达的影响。结果:1.糖肾康可改善db/db小鼠的一般状况,改善糖代谢,与模型组比较,糖肾康组及缬沙坦组的UACR均明显降低(P<0.01),亦改善了NAG(P<0.01)、β2-MG(P<0.01或P<0.05)、Scr(P<0.01)、BUN(P<0.01)、及Cys C(P<0.01)等肾损伤指标;糖肾康组Nephrin的蛋白表达明显增加(P<0.01),且优于缬沙坦组(P<0.05)。糖肾康可明显降低小鼠肾组织细胞焦亡炎性因子NLRP3(P<0.05)、Caspase-1(P<0.01)、IL-18(P<0.01)及IL-1β(P<0.01)的表达。糖肾康组可改善GBM增厚,改善足细胞融合和内皮细胞窗孔结构和系膜基质堆积等糖尿病肾脏病理改变。2.MTT法筛选出糖肾康含药血清的最佳作用浓度为3.84g/kg,此浓度下足细胞活力最强,凋亡率最低。糖肾康组可显著降低高糖诱导的足细胞LDH释放率(P<0.01),降低NLRP3(P<0.05)、Caspase-1(P<0.05)、IL-18(P<0.01)及IL-1β(P<0.01)的表达。随着高糖作用时间的延长,足细胞中的MALAT1表达水平出现升高趋势,其中6h时达到峰值,且这些变化与渗透压无关。敲减MALAT1后,足细胞活力明显增加,NLRP3(P<0.01)、Caspase-1(P<0.01)、IL-18(P<0.01)及IL-1β(P<0.01)的表达明显降低。3.DNA甲基化抑制剂5-Aza-Cd R可减少NLRP3(P<0.05)、Caspase-1(P<0.01)、IL-18(P<0.01)及IL-1β(P<0.01)的表达。高通量甲基化捕获测序,结果发现,高糖组与对照组相比较,甲基化下调基因2379个,糖肾康组与高糖组相比较,甲基化上调基因1799个,其中,212个基因经糖肾康干预后,发生了甲基化由下调到上调的改变。GO分析发现,在分子功能方面,主要集中于转录调控区DNA结合、磷脂酰肌醇3-激酶调节活性、MHC II类蛋白结合。在细胞组分方面,主要集中NSC125066浓度于细胞连接、突触、内动力蛋白臂。在生物过程方面,主要集中于多细胞生物生长、内质网的正调控、突触组装的负调控。通过KEGG分析对甲基化基因进行通路富集发现,主要集中在调节干细胞多能性的信号通路、黏着斑、Wnt信号通路等方面。高糖组与对照组相比较,甲基化上调基因2566个,糖肾康组与高糖组相比较,甲基化下调基因3414个,其中,326个基因经糖肾康干预后,发生了甲基化由上调到下调的改变。GO分析发现,在分子功能方面,主要集中于蛋白结合、转录抑制活性,RNA聚合物。在细胞组分方面,主要集中于核转录因子复合物、细胞质。在生物过程方面,主要集中于转录调控DNA模板、趋化性的调节、血管生成。通过KEGG分析对甲基化基因进行通路富集发现,主要集中在PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路及MAPK信号通路方面。4.结合网站预测MALAT1的可能转录因子及甲基化差异基因谱,发现可能调控MALAT1的转录因子有9个,分别是COE1、E2F-1、GATA-2、HNF-3、HNF-3beta、HNF-6、Myo D、Nkx2-1、Sp1。q PCR验证显示,Sp1的表达水平更高且三组之间有差异性。双荧光素酶报告基因系统验证了转录因子Sp1与MALAT1基因的启动子区是可以结合的,进而调控基因的表达,证明转录因子Sp1和MALAT1基因的启动子区存在调控关系。加入DNA甲基化抑制剂后,Sp1表达明显减少(P<0.01),MALAT1的表达(P<0.01)与Sp1的表达趋势具有一致性,且Sp1的减少量更明显,说明DNA甲基化抑制剂主要影响了Sp1的表达,而MALAT1除了因受到Sp1的表达减少而降低外,可能还受到其他因素的影响,糖肾康对二者的影响与DNA甲基化抑制剂的效果无明显差异,说明糖肾康可能也通过影响DNA甲基化影响了Sp1及MALAT1的表达。结论:1.糖肾康可明显改变db/db小鼠的一般情况,增加nephrin表达,降低尿蛋白,改善肾功能,糖肾康可通过减少细胞焦亡,发挥对DKD小鼠的肾脏保护作用。2.高糖可诱导足细胞中MALAT1表达增加,MAselleck HPLCLAT1通过NLRP3-caspase-1-IL-1β/IL-8途径参与了足细胞焦亡过程,糖肾康可通过减轻细胞焦亡发挥足细胞保护作用。3.DNA甲基化参与了高糖诱导足细胞的焦亡的过程,进一步高通量甲基化捕获测序确定了高糖诱导的足细胞发生DNA甲基化的基因,其中的差异甲基化转录因子Sp1通过与MALAT1基因的启动子区相结合,发挥了对MALAT1的调控作用。4.表观遗传修饰通过调控足细胞焦亡参与了DKD进展,其机制可能是通过Sp1甲基化-MALAT1-NLRP3轴发挥作用——Sp1甲基化通过影响MALAT1,激活了细胞焦亡的关键因子NLRP3炎性体,进一步通过NLRP3-caspase-1-IL-1β/IL-18轴促进炎症因子表达,导致了足细胞焦亡。而具有益肾活血清泄功效的中药糖肾康或正是以影响甲基化为主要作用靶点,发挥保护足细胞的作用,从而延缓DKD的病理进程。