由于我国奶牛养殖方式逐渐趋向于集约化发展,以酮病为代表的奶牛代谢性疾病发病率也随之升高。奶牛因泌乳所需的能量急剧增加的同时干物质采食量(Dry Matter Intake,DMI)降低,致使机体进入能量负平衡状态(Negative Energy Balance,NEB),而后产生大量的酮体,进而引发酮病。在酮病奶牛体内,高浓度的非酯化脂肪酸(Nonesterified Fatty Acids,NEFA)会产生脂毒作用,从而损伤线粒体的功能,增多活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的含量,导致多个器官/组织(如肝脏和脂肪组织)的凋亡。患有酮病的奶牛在泌乳量方面有所减弱。奶牛乳腺上皮细胞是奶牛乳腺中合成以及泌乳的基本功能单位,其功能紊乱会导致泌乳量降低。线粒体是构成细胞的重要组成部分,其维持细胞正常功能起着至关重要的作用。线粒体损伤会致使奶牛乳腺上皮细胞功能紊乱而影响泌乳量。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorγCoactivator-1,PGC-1α)对线粒体功能有着重要影响。但线粒体功能紊乱在酮病奶牛乳腺组织凋亡中的作用机制尚不明确。因此本研究旨在明确PGC-1α对奶牛乳腺上皮细胞线粒体功能的影响,探究酮病奶牛凋亡的机制,为酮病奶牛乳腺功能损伤问题的防治提供思路和治疗靶点。在本研究中,我们分别通过体内试验与体外试验两个方面进行探讨。一、在体内试验中:采集健康奶牛,亚临床(Subclinical Ketosis,SCK)和临床型(Clinical Ketosis,CK)酮病奶牛的乳腺组织样品。通过免疫组化检测凋亡情况;通过Western blot检测线粒体功能、凋亡通路蛋白与PGC-1α蛋白的表达变化。结果发现,与健康组奶牛相比,CK组奶牛乳腺组织中线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)复合物:COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的蛋白水平表达量均显著下降(P<0.05),说明CK组奶牛乳腺组织存在线粒体功能障碍。免疫结果显示,与健康奶牛组相比,酮病奶牛乳腺组织中TUNEL阳性细胞增多,表明酮病奶牛乳腺组织凋亡通路被激活。与健康奶牛相比,SCK和CK组PGC-1α的蛋白表达均显著下降(P<0.05)。基于上述研究,提出酮病奶牛严重的代谢紊乱可以诱发乳腺组织PGC-1α介导的线粒体功能障碍,诱导Mito-ROS升高导致凋亡的科学假设。二、在体外试验中:通过培养奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T,添加3.6MDV3100采购 mM的BHBA刺激MAC-T细胞构建乳腺上皮细胞酮病体外模型进行研究。结果显示,在BHBA处理6 h、12 h和24 h后,MAC-T细胞中线粒体OXPHOS复合物COⅠ-Ⅴ的蛋白表达水平呈时间梯度依赖性降低(P<0.05);BHBA处理6 h、12 h、24 h后Mito-ROS的产生增加(P<0.05);BHBA处理24 h后,组中线粒体膜电位(Δψm)显著降低(P<0.05),caspase 3与caspase 9的蛋白表达水平显著上升,而Bcl-2/Bax的蛋白表达水平显著下降(P<0.05);通过流式细胞术检测凋亡率,与对照组相比,BHBA处理6 h、12 h、24 h后凋亡率显著上升(P<0.05)。BHBA处理后,在12 h、24 h组中PGC-1α蛋白表达显著降低(P<0.05)。以上表明,BHBA可能通过抑制PGC-1α诱导奶牛乳腺上皮细胞线粒体功能紊乱,进而导致Mito-ROS增加,并改变了线粒体膜电位,引起凋亡发生。为了研究PGC-1α介导的线粒体功能对奶牛乳腺上皮细胞中凋亡的调控机制。本研究在MAC-T细胞中使用PGC-1α抑制剂SR-18292预处理后添加3.6 mM的BHBA再次处理。结果发现,添加SR-18292处理后,降低PGC-1α、NRF1Deep neck infection以及TFAM的蛋白表达水平(P<0.05)。通过降低COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的蛋白表达,加剧了BHBA诱导的线粒体功能紊乱;通过增加Mito-ROS产生改变线粒体膜电位,使之下降,进而激活凋亡通路,增加caspase 3与caspase 9的蛋白表达同时降低Bcl-2/Bax的蛋白表达水平,加剧了BHBA诱导的凋亡。而后添加PGC-1α激活剂ZLN005预处理后添加3.6 mM的BHBA再次处理MAC-T细胞,结果显示PGC-1α、NRF1以及TFAM的蛋白表达水平升高(P<0.05)。通过升高COⅠ、COⅡ、COⅢ、COⅣ和COⅤ的蛋白表达,缓解了BHBA诱导的线粒体功能紊乱;通过降低Mito-ROS产生改变线粒体膜电位,使之上升,caspase 3与caspase 9的Western blot检测结果显示蛋白表达量降低(P<0.05),同时升高BcPF-6463922研究购买l-2/Bax的蛋白表达水平(P<0.05),改善了BHBA诱导的凋亡。这些结果证实,在奶牛乳腺上皮细胞中PGC-1α通过参与调控线粒体功能进而缓解BHBA诱导的凋亡。综上所述,酮病奶牛乳腺上皮细胞发生线粒体功能障碍,引发凋亡,而PGC-1α介导的线粒体功能在其中起调控作用。