Micro RNAs(miRs)在致癌、抑癌,耐药等生物进程中发挥着越来越重要的作用。近年来,许多报道证实miRs和肝门胆管癌的发生发展有关,而且基于miRs的治疗很有可能会成为肝门胆管癌的一种有效治疗手段。众所周知,缺氧是恶性实体肿瘤重要的生物学特征之一。肝门胆管癌作为一种恶性实体肿瘤,在缺氧条件下肿瘤细胞为适应这种改变会分泌大量富含miRs的外泌体来完成其血管生成、增殖、转移等生物学行为。我们课题组前期研究发现,缺氧条件下肝门胆管癌细胞分泌的外泌体不仅在粒径和数量上增加,而且外泌体内miRs的表达谱也发生了改变。迄今为止,虽然调控肿瘤外泌体内miRs差异表达的机制尚未明了,但是RNA结合蛋白介导外泌体miRs分选已经得到证实。有研究发现异构核核糖核蛋白A2B1(HNRNPA2B1),作为一种RNA结合蛋白可以通过泛素化及数量变化介导外泌体miRs的装载。我们试图通过生物信息学分析方法和相应的实验来明确HNRNPA2B1是否参与缺氧条件下肝门胆管癌细胞外泌体中特定miRs的分选并发挥促进肿瘤血管生成的效应。目的:探讨与缺氧肝门胆管癌血管生成相关miRs进入外泌体的相关机制。主要阐明缺氧状况下HNRNPA2B1是否参与肝门胆管癌细胞外泌体miR-155-5p分选过程以及该过程是否参与肿瘤血管形成。方法:本研究通过生物信息学方法筛选出缺氧条件下肝门胆管癌细胞外泌体差异表达的miRs中,与HNRNPA2B1最有效结合的肿瘤血管生成相关的miR为miR-155-5p。采用蛋白Weston-Blot(WB)和纳米颗粒追踪技术(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)验证缺氧和常氧QBC939细胞外泌体的提取。WB和q RT-PCR验证缺氧和常氧状态下,HNRNPA2B1表达情况。通过RNA免疫沉降技术(RNA immunoprecipitation,RIP)观察缺氧和常氧情况下HNRNPA2B1和miR-155-5p的结合状况。通过q RT-PCR检测siRNA干扰QBC939细胞HNRNPA2B1后,细胞及外泌体miR-155-5p的表达情况。采用成管实验研究缺氧情况下,QBC939细胞HNRNPA2B1和外泌体miR-155-5p对HUVECs血管生成及VEGF-A表达的影响。结果:通过生物信息学方法分析可知,依据HNRNPA2B1和缺氧肝门胆管癌外泌体miRs表达上升2倍以上的miRs的结合情况,以及通过数据库筛选的与血管生成相关的miRs,取交集,最终筛选出缺氧条件下肝门胆管癌细胞外泌体中miR-155-5p为与HNRNPA2B1结合能力较强且与肿瘤血管生成密切相关。WB检测结果显示,常氧及缺氧诱导下肝门胆管癌QBC939细胞外泌体均表达CD9、TSG101特异标记蛋白;NTA分析表明常氧及缺氧条件下肝门胆管癌QBC939细胞的外泌体颗粒的直径约为90-150 nm,表明在常氧或缺氧条件下,从QBC939细胞的培养基中成功分离了外泌体。在缺氧条件下,WB定量分析显示,QBC939细胞HNRNPA2B1表达量增加至常氧状态下的2.43倍(P<0.0001);而QBC939细胞外泌体内HNRNPA2B1的表达量达到了常氧状态下的2.96倍(P<0.0001);q RT-PCR显示缺氧条件下,QBC939细胞HNRNPA2B1表达量增加到常氧下的1.88倍(P<0.0Z-IETD-FMK001)。RIP技术反映缺氧和常氧条件下miR-155-5p与HNRNPA2B1均有相互作用,其中缺氧条件下检测到的miR-155-5p含量是常氧状态下的1.43倍。qRT-PCR验证siRNA干扰QBC939细胞HNRNPA2B1后,细胞和外泌体miR-155-5p表达情况,结果显示,干扰组(KD组)外泌体miR-155-5p表达量较无义序列对照组(NC组)减少了66.4%,然而细胞miR-155-5p表达量,在KD组和NC组间无统计学差异。成管实验表明,缺氧状态下,干扰HNRNPA2B1表达后QBC939细胞的外泌体(KD-EXO),对HUVECs血管形成能力的促进作用与来源于NC组QBC939细胞的Infected total joint prosthetics外泌体(NC-EXO)相比,下降了55.5%(P<0.0001)。NC-EXO和miR-155-5p inhibitors同时作用于HUVECs,HUVECs血管生成能力较单用NC-EXO减少了32.3%(P<0.001);而将KD-EXO和miR-155-5p mimics共同作用于HUVECs,HUVECs血管生成能力比单用KD-EXO增加了1.14倍(P<0.0001)。WB检测不同组别HUVECs中VEGF-A的结果表明,KD-EXO导致的VEGF-A表达较NC-EXO明显减弱;NC-EXO联合转染miR-155-5p inhibitors后VEGF-A的较单用NC-EXO出现了表达下调;KD-EXO通过转染miR-155-5p mimics后,VEGF-A的表达又出现了增加,各组别VEGF-A表达与HUVECs的血管形成数变化相符合。结论:HNRNPA2B1参与缺氧状态下肝门胆管癌细胞外泌体miR-155-5p分选,而且可https://www.selleck.cn/products/Y-27632.html以通过外泌体中miR-155-5p促进肿瘤血管生长。