研究背景塑料作为一种人造材料,因成本低、坚固耐用且易于生产,被广泛应用于各行各业当中。微纳塑料(Micro-/nano-plastics,MNPs)在陆地、水生和大气系统等自然生态系统中无处不在。由于MNPs具有较大的比表面积和较强的表面疏水性,它们很容易吸附和富集重金属和有机污染物等。此外,大多数塑料产品在成型过程中添加了一些塑料添加剂以改变聚合物的性能,使塑料产品更耐用和可持续。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl Phthalate),DEHP)是一种广泛用于塑料制品生产的增塑剂,被应用于塑料产品、化妆品、玩具以及medical reference app医疗器具等产品中,这些塑料添加剂可以在塑料制品破碎过程中以微塑料的形式释放到环境中。聚苯乙烯(Polystyrene,PS)产量高、分布广泛且对疏水性有机污染物具有较强吸附能力,因此,PS和DEHP在生态环境中极有可能造成复合污染,然而目前PS与DEHP联合暴露毒性研究仍然非常有限,PS能否载带和释放DEHP到体内以及联合暴露是否会给神经系统带来更大的危害,目前尚不清楚。研究目的本研究依据环境暴露浓度选择三种微、纳尺度PS粒子和DEHP,通过建立小鼠亚慢性长期口服暴露模型,评价PS与DEHP联合暴露对小鼠神经行为的影响,并探究其毒性作用的分子机制,为MNPs与环境污染物复合暴露的健康风险评估提供研究数据和参考。研究方法1.PS材料表征以及对DEHP的吸附。我们采用扫描电子显微镜观察PS粒子的形态,采用纳米粒度分析仪检测PS粒子水动力学直径和Zeta电位,采用傅里叶红外光谱检测PS材料的成分,采用共聚焦显微镜拍摄荧光信号,确定尼罗红标记PS粒子是否能产生稳定的荧光。其次我们采用气相色谱-质谱联用仪(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)检测DEHP在PS上的吸附量。2.PS和DEHP联合暴露亚慢性暴露动物模型建立。将小鼠随机分为9组:空白对照组(C组),溶剂对照组(SC组),DEHP组,PS组(PS50/500/5000),PS与DEHP复合暴露组(PS50/500/5000+DEHP)。PS和DEHP给药剂量分别为50mg/kg·bw/day和0.5 mg/kg·bw/day,灌胃染毒90 d。3.PS和DEHP联合暴露在小鼠体内分布及整体毒性效应。通过共聚焦显微镜和荧光比色法检测荧光PS粒子在小鼠脑、肠、肝、肾、睾丸和血液中的蓄积。采用GC-MS检测DEHP和其初级代谢产物邻苯二甲酸-单-2-乙基己酯(Mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)在小鼠脑、肠、肝、肾、睾丸和血液中的蓄积。采用全自动血液细胞分析仪检测血常规,使用全自动生化分析仪检测血清中血生化指标。通过ELISA方法检测血清炎性指标,应激激素和雄激素。根据试剂盒检测血清中氧化应激水平。4.PS和DEHP联合暴露神经毒性效应。暴露结束后采用旷场、水迷宫和避暗实验对小鼠的行为和学习记忆能力进行评价。通过HE染色、尼氏染色和电镜观察小鼠海马和皮质结构变化。通过FITC-Dextran染色检测小鼠血脑屏障通透性。采用免疫荧光方法检测海马血脑屏障紧密连接蛋白,小胶质和星形胶质细胞激活标志物,性激素受体相关蛋白表达。采用免疫组化检测海马炎性因子的表达。采用荧光比色法检测海马活性氧水平并根据试剂盒检测氧化应激水平。通过TUNEL实验检测海马组织的凋selleck NMR亡率。通过WB实验检测海马NF-κB通路,凋亡和自噬相关蛋白。采用靶向代谢组学和ELISA检测海马神经递质水平。5.磷酸化修饰蛋白质组学分析及验证。我们采用磷酸化修饰蛋白质组学技术,分析PS50和DEHP单独及其联合暴露对小鼠海马磷酸化蛋白组学的影响,采用WB实验检测阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)相关通路蛋白表达。采用甘氨酸银染检测海马老年斑和神经缠绕成结现象,通过比色法和ELISA检测相关神经递质谷氨酸和D-丝氨酸水平,采用比色法检测Ca~(2+)水平。6.体外小鼠海马神经元细胞(HT22)暴露模型构建。通过50 nm PS和MEHP干预HT22细胞24h,通过CCK8法检测细胞活力,使用共聚焦显微镜观察HT22细胞对荧光50 nm PS的摄取,通过GC-MS检测HT22细胞对MEHP的摄取,采用荧光比色法检测HT22细胞活性氧水平并根据试剂盒检测氧化应激水平,HT22细胞在预先用或者不用N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)抑制剂美金刚(Memantine,MEM)和三磷酸肌醇受体(Inositol 1,4,5-triphate receptor,IP3R)抑制剂光溜海绵素C(Xestospongin C,Xe C)处理的情况下,再用相应浓度的PS50和MEHP单独及其联合暴露处理后,通过Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡,通过比色法检测Ca~(2+)和D-丝氨酸含量,通过ELISA法检测Glu含量,通过WB检测AD通路相关蛋白。7.小胶质细胞(BV2)及与HT22细胞共培养模型建立。通过50 nm PS和MAMG510EHP干预BV2细胞24 h,通过CCK8法检测细胞活力,使用共聚焦显微镜观察BV2细胞对荧光50 nm PS的摄取,通过GC-MS检测BV2细胞对MEHP的摄取,通过ELISA检测BV2炎性因子,Annexin V-FITC/PI双染色法检测共培养细胞凋亡,通过比色法检测共培养细胞Ca~(2+)含量,采用WB方法检测BV2细胞p-NF-κB p65(Ser 536)和HT22/BV2共培养细胞AD标志蛋白的表达。8.肠-脑轴机制探讨。通过HE染色和电镜观察小鼠结肠结构变化。采用免疫荧光检测肠道屏障以及性激素受体相关蛋白,采用ELISA方法检测结肠炎性因子和重要神经递质水平。通过16S r DNA基因测序检测肠道菌群的变化,通过靶向代谢组学检测短链脂肪酸含量。研究结果1.PS和DEHP在体内分布规律及其整体毒性效应。PS能够吸附DEHP且吸附量在98%以上。PS均能进入小鼠血液,50 nm PS在脑、肠、肝、肾和睾丸中均有显著蓄积,500 nm PS在肠、肝、肾和睾丸中显著蓄积,且50和500 nm PS更易在肠中富集,5μm PS在小鼠肝和肾中显著蓄积且更易在肝中富集。PS与DEHP复合暴露后,PS能够载带DEHP并显著增加其在脑、肠、肝、肾、睾丸和血液中的含量;同时显著增加脑内MEHP含量,尤其是50 nm PS与DEHP复合暴露后脑内MEHP含量最高。PS单独及其与DEHP复合暴露后,DEHP和MEHP在体内的含量均呈现粒径依赖性,PS粒径越小其含量越高。PS与DEHP单独及其联合暴露能使血常规、肝功能、肾功能和血脂指标发生变化,并影响血清炎性因子、氧化应激、应激激素和雄激素水平。联合暴露能够增加单独暴露诱导的整体毒性,并随粒径增大其影响逐渐减弱。2.PS和DEHP单独及其联合暴露的神经毒性效应。PS和DEHP联合暴露能够影响小鼠运动活动,导致焦虑行为幷使学习记忆能力下降。PS和DEHP单独及其联合暴露均会损伤小鼠海马和皮质的结构,增加海马血脑屏障通透性,诱导神经炎症,影响氧化应激水平,导致海马凋亡和自噬增加,降低性激素受体水平,还导致海马内多种神经递质的改变,联合暴露会增加单独暴露诱导的神经毒性,并随粒径增大其影响逐渐减弱。3.PS和DEHP单独及其联合暴露诱导小鼠AD样病变及机制探讨。我们通过分析差异磷酸化蛋白肽段,筛选出AD信号通路,发现老年斑和神经纤维缠绕成结的现象,上调AD标志蛋白Aβ_(1-42)及APP、Tau、p-Tau(Ser396)和p-Tau(Thr231),NMDAR Ca~(2+)通道相关神经递质Glu和D-Ser及Grin2b、p-Grin2b(Tyr 1472)、Grin1和p-Grin1(Ser 890)蛋白,IP3R Ca~(2+)通道相关蛋白GPCR和IP3R,Ca~(2+)及下游激酶Ppp3cb和p-ERK1/2(Thr 202/Tyr 204)蛋白,内质网应激相关蛋白Bip、p-PERK(Thr 982)、p-el F2α(Ser 51)、ATF4、CHOP和C-Caspase12水平,下调了p-GSK3β(Ser 9)蛋白水平。与单独PS50和DEHP暴露相比,PS50和DEHP联合暴露导致上述指标的变化更显著。4.PS与DEHP联合暴露诱导AD病变的直接作用分子机制。我们通过建立HT22细胞模型对其机制进行研究,结果表明,PS50+MEHP能导致HT22细胞活力下降,50 nm PS能够进入细胞,MEHP含量增加,影响氧化应激水平,上调了AD重要的标志蛋白Aβ_(1-42)及APP和p-Tau(Ser 396),NMDAR Ca~(2+)通道相关神经递质Glu和D-Ser及p-Grin2b(Tyr 1472)和p-Grin1(Ser 890)蛋白,IP3R Ca~(2+)相关GPCR和IP3R蛋白,Ca~(2+)及下游激酶Ppp3cb、GSK3β和p-ERK1/2(Thr 202/Tyr204)蛋白,内质网应激相关蛋白Bip、p-PERK(Thr 982)、p-el F2α(Ser 51)、ATF4、CHOP和C-Caspase12,凋亡率及凋亡蛋白Bax、C-Caspase9和C-Caspase3,自噬相关蛋白Beclin1和LC3的蛋白表达水平;下调了激酶p-GSK3β(Ser 9),凋亡蛋白Bax,自噬蛋白p62的蛋白表达水平;与单独PS和MEHP暴露相比,50 nm PS与MEHP联合暴露导致上述指标的变化更显著。并且,给予NMDAR抑制剂MEM和IP3R抑制剂Xe C干预后,能够明显缓解PS50与MEHP联合暴露诱导的AD样病变相关蛋白及信号通路的表达。5.PS与DEHP联合暴露诱导AD病变的间接作用分子机制。通过建立BV2细胞及HT22/BV2共培养细胞模型对其间接机制进行研究,我们发现PS50与MEHP联合暴露能导致BV2细胞活力下降,PS50进入细胞,胞内MEHP含量增加,诱导BV2细胞炎症,上调HT22/BV2共培养细胞凋亡率、Ca~(2+)水平及Aβ_(1-42)和p-Tau(Ser 396)蛋白水平,且与单独PS50和MEHP暴露相比,PS50与MEHP联合暴露导致上述指标更显著的变化。6.肠-脑轴机制探讨。PS和DEHP单独及其联合暴露均能损伤小鼠结肠的结构,增加肠屏障通透性,诱导肠炎症,降低性激素受体水平,改变神经递质水平,联合暴露能够增强单独暴露的毒性作用,并随着PS粒径的减小毒性作用逐渐增强。同时,一些肠道菌群(如Ileibacterium、Acetitomaculum、Desulfovibrio和Oligella)及其代谢产物发生特异性改变,并且与神经行为异常、血脑屏障损伤、神经炎症、神经递质和激素水平呈显著相关性。研究结论1.三种粒径PS粒子均能进入小鼠血液中并在组织中蓄积,与粒径大小有关。PS能够载带DEHP,二者复合暴露后促进DEHP及MEHP进入血液并在各组织中蓄积。MEHP在脑内蓄积最多,提示脑是一个重要靶器官。DEHP和MEHP在体内的含量与PS粒径密切相关,粒径越小其含量越高。2.PS和DEHP单独及其联合暴露诱导机体炎性损伤、氧化应激及激素水平紊乱,联合暴露的毒理效应更显著,且小粒径的作用效果明显大于大粒径。3.本研究从体内外实验证明,PS和DEHP单独及其联合暴露均具有神经毒性,且PS粒径越小毒性效应越高。通过NMDAR和IP3R Ca~(2+)通道导致Ca~(2+)超载,最终诱导小鼠和神经元细胞出现AD样病变,联合暴露引起的毒性效应高于单独暴露。4.PS与MEHP联合暴露可以通过激活小胶质细胞NF-κB信号通路,促其释放炎性因子,进而诱导神经元损伤。5.PS与DEHP联合暴露可引起小鼠肠道菌群及其代谢产物的改变,破坏肠屏障并通过肠脑轴途径发挥神经毒性作用。