新发呼吸道传染病病原体—新型冠状病毒在全球肆虐,佩戴适合的口罩是控制呼吸道传染病蔓延最经济、有效的方法之一。目前,市面上售卖的口罩主要包括普通一次性口罩,一次性医用外科口罩和医用防护口罩三大类别,其品牌多种多样,过滤效率、舒适程度以及质量保障水平也良莠不齐。市面售卖的口罩大部分主要通过物理阻隔和静电吸附达到防护效果,均不具备抑菌和杀毒作用。基于此,课题组前期配制了含纳米银(silver nanoparticles,Ag NPs)/溴化十六烷基吡啶(cetylpyridine bromide,CPB)两种抗菌剂的醋酸纤维素聚合溶液以及含壳聚糖(chi-tosan,CS)/十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bro-mide,CTAB)两种抗菌剂的聚环氧乙烷和聚乙内酯聚合物溶液,利用静电纺丝技术制备出含不同浓度纳米银和溴化十六烷基吡啶抗菌剂的醋酸纤维素纺丝薄膜13种和含不同浓度壳聚糖和十六烷基三甲基溴化铵的聚环氧乙烷-聚乙内酯薄膜12种。本阶段的研究主要是:通过对25种自组装新型口罩关键材料进行生物安全评价、筛选安全性符合国家GB/T 16886.5-2017标准的口罩关键材料,并完成过滤性能及抑菌性能等相关微生物学评价,探索新型具有抑菌功能静电纺丝复合薄膜的应用前景,为研发新型抗菌口罩关键材料提供参考。实验内容分3部分完成。第一部分2Empagliflozin供应商5种含不同抗菌剂的自组装纳米静电纺丝抗菌材料的安全性评价及筛选目的:通过对利用静电纺丝技术制备的13种含不同浓度纳米银和溴化十六烷基吡啶的醋酸纤维素复合纳米抗菌口罩材料及12种含不同浓度的壳聚糖和十六烷基三甲基溴化铵的环氧乙烷-聚乙内酯抗菌材料进行安全性评价及筛选,探讨新型研发的抗菌口罩材料的生物安全性及应用前景,为抗菌口罩材料的研发提供依据。方法:取含不同浓度纳米银和溴化十六烷基吡啶的醋酸纤维素复合纳米抗菌口罩材料13种,命名为LL1-LL13及含不同浓度的壳聚糖和十六烷基三甲基溴化铵的环氧乙烷-聚乙内酯抗菌材料12种,命名为T1-T12,以MEM细胞完全培养基为浸提介质,经0.22μm滤膜滤过,制备无菌浸提液。1.分别以25种材料的100%无菌浸提液培养小鼠成纤维细胞(NCTC clone 929,L929)为实验组;MEM细胞培养液培养L929细胞为阴性对照组,应用MTT比色法,检测不同复合薄膜的细胞毒性,筛选出符合GB/T 16886.5-2017要求,24 h内细胞相对增殖率不低于70%的抗菌材料。对符合要求的抗菌材料的浸提液稀释,利用MTT比色法,对稀释液再次进行细胞毒性检测。2.以方法1中筛选出的符合要求的三种自组装纳米静电纺丝抗菌材料100%浸提液为实验组,MEM细胞培养液为阴性对照组,利用光BMS-907351纯度学显微镜,观察筛选出的抗菌材料中抗菌剂对L929细胞形态的影响。3.以方法1中筛选出的符合要求的三种自组装纳米静电纺丝抗菌材料为实验组,无菌脱脂棉浸泡生理盐水为阴性对照组,无菌脱脂棉浸泡4%甲醛溶液为阳性对照组。分别在各组材料与新西兰兔皮肤接触24 h、48 h、72 h后,观察并记录皮肤接触部位的红斑及水肿情况,确定三种纳米抗菌材料对新西兰兔皮肤的刺激性,明确各组的原发性刺激指数(primarily irritation index,PII);记录期结束后,接触部位皮肤组织取材,经HE染色后,观察刺激部位皮肤组织真皮层中炎性细胞的聚集及浸润情况。4.取30只豚鼠,随机分为5组,每组6只。以1中筛选出的符合要求的三种自组装纳米静电纺丝抗菌材料100%浸提液为实验组,生理盐水为阴性对照组,4%甲醛溶液为阳性对照组。经皮内诱导、局部诱导、激发后,观察各组豚鼠激发处皮肤的红斑和水肿情况,明确材料致敏性;应用HE染色,观察豚鼠激发部位皮肤组织真皮层中炎性细胞浸润情况。结果:1.体外细胞毒性实验结果显示,仅LL11、LL12和LL13即纳米银醋酸纤维素薄膜(cellulose acetate/silver nanoparticles,CA/Ag NPs)、溴化十六烷基吡啶醋酸纤维素薄膜(cellulose acetate/cetylpyridine bromide,CA/CPB)和纳米银溴化十六烷基吡啶醋酸纤维素薄膜(cellulose ace-tate/silver nanoparticles/cetylpyridine bromide,CA/Ag NPs/CPB)满足GB/T 16886.5-2017要求,24 h内100%浸提液的细胞存活率下降,但不小于70%。CA/Ag NPs,CA/CPB,CA/Ag NPs/CPB三种抗菌材料25%、50%、75%、100%四个稀释度浸提液的细胞毒性结果:24 h时CA/Ag NPs各组与control组比较均无统计学意义(F=0.9862,P>0.05);CA/CPB组中25%、50%、75%、100%四个稀释度与control组比较均有统计学差异(F=23.52,P<0.05);CA/Ag NPs/CPB组中50%、75%、100%三个稀释度与control组比较有统计学差异(F=18.26,P<0.05)。2.光学显微镜下,阴性对照组细胞呈正常的梭形或不规则三角形,各实验组细胞形态均存在一定程度胞体变细长、扁平,胞质增多的改变,且随接触时间延长各组浸提液对细胞形态影响愈加明显。3.皮肤刺激实验结果:CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB三组原发性刺激指数分别是0、0、0.1,阴性对照组是0,均为无刺激;阳性对照组原发性刺激指数是5.0,为强刺激。与阳性对照组比较,三个实验组原发性刺激指数显著降低,具有统计学差异(F=25.44,P<0.05)。皮肤组织HE染色结果显示,阳性对照组真皮层中可见大量炎性细胞浸润,阴性对照组真皮层中炎性细胞显著减少,实验组与阴性对照组类似,与阳性对照组形成显著差异。4.皮肤致敏实验结果:大体肉眼观察,豚鼠腹部皮肤激发去除致敏原后,与阳性对照组比较,24 h、48 h和72 h内各实验组及阴性对照组实验动物上腹部皮肤均没有出现明显的红斑和水肿等炎症反应。皮肤HE染色结果显示,阳性对照组皮肤组织真皮层中大量嗜酸性粒细胞浸润与阴性对照组和实验组形成显著差异。结论:LL11、LL12、LL13即CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB三组材料符合GB/T 16886.5-2017医疗器械生物安全评价规定,无皮肤刺激性和致敏性,有望成为制备新型抗菌口罩的材料。第二部分不同类别新型抗菌口罩材料细菌过滤效率和抑菌性能实验研究目的:检测医用外科口罩、一次性防护口罩、N95型防护口罩和CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB三种静电纺丝复合薄膜对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的过滤效率(bacterial filtration efficiency,BFE)以及三种抗菌复合薄膜的抑菌效果,评估CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB三种抗菌薄膜的阻隔性能及抗菌性能,探索抗菌型口罩材料的应用前景并为研发新型抗菌口罩材料提供参考。方法:1.利用TK-3型气溶胶发生器和FA-1H型微生物采样器,通过物体表面采样、细菌培养和菌落计数,检测医用外科口罩、一次性防护口罩、N95型防护口罩以及三种静电纺丝复合薄膜抗菌口罩材料CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB在静息气流量5 L/min下抽吸30 min、60 min、120 min、240 min后,各吸气时间点对大肠埃希菌ATCC 25922和表皮葡萄球菌ATCC 12228的过滤效率。比较不同一次性口罩以及抗菌材料对不同细菌过滤效果的差异,评价新研发抗菌材料细菌过滤能力bio-dispersion agent以及对不同细菌过滤效果的差异。2.以大肠埃希菌ATCC 25922为代表,检测三种一次性口罩以及三种静电纺丝复合薄膜抗菌口罩材料CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB在不同吸气流量10 L/min、20 L/min、30 L/min下分别抽吸30 min后,过滤效率的改变。3.参考FZ/T 73023-2006,抗菌针织品;采用琼脂扩散法,测量CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB三种抗菌薄膜对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌和肺炎克雷伯菌的抑菌带直径,定性评价三种抗菌薄膜材料的抑菌效果。结果:1.30 min时医用外科口罩、一次性防护口罩、N95型防护口罩对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的过滤效果均无差异,BFE都在98%以上(P>0.05);60 min以及120 min时N95型防护口罩对大肠埃希菌的过滤效果高于医用外科口罩和一次性防护口罩(P<0.05),医用外科口罩和一次性防护口罩对大肠埃希菌的过滤效果没有统计学差异(P>0.05),三种口罩对表皮葡萄球菌的过滤效果均没有统计学差异(P>0.05);240 min时,N95型防护口罩对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的过滤效率均高于医用外科口罩(P<0.05)且与一次性防护口罩比较不存在统计学差异(P>0.05)。整体防护效果:N95型防护口罩高于一次性防护口罩和医用外科口罩。三种抗菌材料对大肠埃希菌的过滤效率30 min～240 min分别为:LL11-CA/Ag NPs为89.78%,87.28%,75.23%,69.41%,LL12-CA/CPB为84.52%,83.38%,77.47%,68.79%,LL13-CA/Ag NPs/CPB为84.39%,72.49%,68.23%,49.88%;对表皮葡萄球菌的过滤效率:LL11-CA/Ag NPs为99.61%,99.54%,97.19%,93.93%,LL12-CA/CPB为99.61%,98.05%,95.73%,86.91%,LL13-CA/Ag NPs/CPB为99.45%,98.37%,97.44%,83.67%。整体上,LL11高于LL12、LL13,三种材料对表皮葡萄球菌的BFE略高于大肠埃希菌。2.一次性口罩和三种抗菌材料对大肠埃希菌气溶胶过滤效果,均随通气流量升高,逐渐降低。3.CA/Ag NPs、CA/CPB、CA/Ag NPs/CPB抑菌带均≥0.5 mm,且试样下无细菌繁殖,依据GB/T 20944.1-2007和FZ/T 73023-2006判定标准,可认为均具有较好的抗菌效果。结论:静息状态下连续使用240 min,N95型防护口罩对细菌气溶胶的过滤效果高于一次性防护口罩和医用外科口罩,自组装纳米静电纺丝抗菌材料CA/Ag NPs和CA/CPB对细菌气溶胶的过滤效果与医用外科口罩相当(H=2.000,P>0.05),经改进后有望成为抗菌口罩滤材。第三部分Staphylococcus epidermidis可视化LAMP反应体系的建立并应用于新材料过滤性能的快速检测目的:建立环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)可视化快速检测表皮葡萄球菌体系,并应用于口罩过滤后样品的快速检测,探讨利用LAMP检测材料过滤效果的可行性,为即时检测材料过滤效果提供思路,并应用于指导口罩使用及更换。方法:1.提取表皮葡萄球菌ATCC 12228基因组DNA,以表皮葡萄球菌ATCC 12228的Ses B基因为研究对象,建立LAMP反应体系,对反应体系中的Mg~(2+)、甜菜碱、反应温度及反应时间进行优化;与实验室中保存的甲型副伤寒杆菌、肺炎克雷伯菌、耻垢分枝杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌比对扩增,确定反应体系的特异性;最后,梯度稀释DNA模板检测反应体系灵敏度,并与PCR进行一致性比较。2.通过直接比较反应前后LAMP反应体系的浊度;在LAMP反应前向体系中分别加入钙黄绿素、中性红指示剂,裸眼观察反应前后颜色变化,对可视化指示剂进行筛选。筛选后的指示剂再应用于LAMP反应体系的优化中,并与2%琼脂糖凝胶电泳图比较,验证其准确性。3.以第二部分研究中,CA/Ag NPs/CPB抗菌口罩材料在不同时间点采集的过滤样品为检测样本,提取DNA。利用优化好的LAMP体系可视化快速检测口罩样本,并与PCR进行比较。结果:1.钙黄绿素和中性红反应前后体系颜色变化均较明显。钙黄绿素阴性为淡橙色,阳性为绿色;中性红阴性为橙黄色,阳性为橙红色。浊度比较反应前后裸眼观察差异较小。钙黄绿素作为可视化染料,在反应体系中相对稳定,最终选择钙黄绿素为可视化染料。2.建立并优化了环介导等温扩增技术可视化检测表皮葡萄球菌反应体系。LAMP反应体系的最适Mg SO_4浓度为4 m M;最适甜菜碱浓度为0.4 M;最适反应温度为63℃;最适反应时间为60 min,反应体系特异性较好,最低检测限为10 copies/μL。PCR最低检测限为10~2copies/μL,LAMP反应的灵敏度比PCR高出10倍。LAMP体系优化评价中钙黄绿素可视化结果与琼脂糖凝胶电泳图结果一致。3.样本检测表明,LAMP和PCR均从30 min开始可以检测到口罩外侧面样本中的表皮葡萄球菌,且LAMP在60 min时可以检测到内侧面样本中的表皮葡萄球菌,PCR在120 min时可以检测到内侧面表皮葡萄球菌。LAMP与PCR两种方法比较Kappa值为0.832,一致性较好。结论:本研究成功建立了可视化环介导等温扩增体系检测表皮葡萄球菌的方法,并应用于新型抗菌材料的细菌过滤检测。LAMP与PCR方法比较,两者在检测效果上并无差异(Kappa=0.832)。该方法可以应用于检测口罩表面污染程度指导使用者及时更换口罩。