研究背景:溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种慢性肠道性的炎症疾病,临床主要表现为消化不良、腹痛、腹泻并伴有溃疡和粪便出血等症状。临床上治疗溃疡性结肠炎的手Gefitinib体内实验剂量段通常包括手术、氨基酸类药物、免疫抑制剂和生物制剂等,但上述方法常伴有不良反应多、价格昂贵或患者耐受性低等弊端,限制了临床治疗的应用。尽管UC的发病机制不明确且缺少精准治疗的靶点,但目前多项研究表明衰老与UC存在相关性。衰老和UC的相关性揭示不仅为UC治疗开辟新道路,也为UC提供了“异病同治”和“老药新用”策略。中医药在抗衰老和抗UC上应用悠久,拥有完善的理论体系,从中医药角度挖掘治疗UC的药物并发现潜在靶点,成为当下研究热潮。药对作为中药复方较为固定的搭配使用形式,其研究对于临床疾病治疗、推动创新药物研发、揭示复方配伍规律意义重大。目的:基于延年益寿方剂,筛选具有抗衰老作用的中药药对,验证其对UC的疗效及作用机制,探索衰老和UC之间的潜在关系,丰富UC的临床治疗依据。方法:首先SymMap数据库用于筛选衰老关联中药,数据挖掘技术筛选抗衰老药对;体内实验中,利用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium,DSS)构建小鼠UC模型,体重变化、疾病活动指数(Disease activity index,DAI)、脾脏重量、结肠长度、病理变化染色用于评估UC疾病发生发展;分子生物学实验:逆转录聚合酶链反www.selleck.cn/products/s63845应(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western Blot,WB)用于检测相关因子和蛋白的表达水平;高通量技术:转录组学和代谢组学用于作用机制研究;胚胎干细胞DNA同源重组技术构建的转基因小鼠用于验证关键因子的作用;激动剂、抑制剂用于信号通路干预。结果:(1)数据挖掘技术筛选出抗衰老中药药对-人参茯苓药对筛选出与衰老关联的中药-人参,得到抗衰老中药药对-人参茯苓药对(Drug Pair ofbiogas technology GINSENG RADIX ET RHIZOMA(“人参”)and PORIA(“茯苓”),DPGP)。(2)体内实验验证了DPGP的抗UC作用DPGP能够抑制DSS诱导的UC小鼠体重下降、DAI评分升高、结肠长度缩短、病理损伤;qRT-PCR结果显示DPGP下调小鼠结肠中促炎因子Il1b、Il6、Tnf、Infg的转录水平;WB结果显示,DPGP抑制炎症小体(Nlrp3、Asc、Casp1)的蛋白表达水平,抑制坏死因子(Ripk1、Ripk3、Mlk1)的蛋白表达水平,促进DNA损伤修复蛋白(H2ax)的磷酸化及细胞周期相关蛋白(Ccnb1、Ccnd1)的表达,以上结果证明了 DPGP通过抑制炎症及恢复肠道细胞功能的抗UC作用。(3)明确了DPGP治疗UC的作用机制转录组学结果显示,DPGP促进抗衰老基因Tppp3,抑制促衰老基因Zbp1的表达,上调Gli1转录因子的表达水平,并调控DNA损伤、细胞衰老、细胞周期过程;代谢组学结果显示,DPGP调节与抑制衰老相关的代谢物富集途径如精氨酸和脯氨酸代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭、甘氨酸和丝氨酸代谢及超长链脂肪酸的β氧化过程,这些结果表明DPGP抗UC作用与调控衰老过程存在相关性。根据DPGP在抗UC的同时调控衰老相关途径,并具有上调GLI1的作用,本研究发现,TERT是受GLI1调控的下游关键因子,同时它也是抗衰老的关键因子。DPGP作用结肠炎小鼠后,能通过促进Gli1转录因子的核转位并诱导Tert mRNA表达,结果表示Gli1-Tert轴是DPGP抗小鼠UC的作用通路。采用抑制剂抑制小鼠Tert活性后,DPGP的抗UC作用显著减弱;采用抑制剂抑制Gli1活性后,DPGP的抗UC作用与促进Tert转录的作用降低。以上结果表示DPGP通过GLI1促进抗衰老因子TERT表达并发挥抗UC作用。(4)明确了 TERT过表达具有抗UC的作用胚胎干细胞DNA同源重组技术构建的Tert过表达转基因小鼠(TertKI小鼠)能够抵抗DSS诱导的体重降低、DAI评分升高、结肠长度缩短、病理损伤;qRT-PCR结果显示,TertKI小鼠结肠中促炎因子转录水平下降,抗炎因子的转录水平升高;WB结果表明,TertKI小鼠抑制促炎因子的蛋白水平;转录组学结果表示TertKI小鼠调控DNA损伤、细胞衰老、细胞周期过程维持基因组稳定性。干预TERT表达,结果显示促进Tert表达能够抑制UC小鼠体重降低、DAI评分升高,抑制结肠长度缩短并降低促炎因子的转录水平;而抑制Tert表达显示出更为严重的UC疾病特征与促炎因子转录水平升高。结果说明了促进TERT表达治疗UC的可行性。结论:基于延年益寿方剂筛选到的抗衰老中药药对-DPGP,从体内实验证明其具有抗UC和抑制炎症作用,其机制是通过促进GLI1蛋白核转位及上调TERT表达;同时,本研究也证明了调控衰老的关键因子TERT具有抗UC作用。研究结果揭示了抗衰老和抗炎之间的相关性,提供了一种能应用于临床UC治疗的中药药对,并通过其作用机制的揭示为其应用奠定理论依据。