目的:本研究拟通过生物信息学分析ASH2L和ALPK1在胃腺癌中的表达及临床意义,初步明确ASH2L和ALPK1在胃癌的发生、发展、诊断及预后中的作用;通过体外细胞实验分析ASH2L和ALPK1在Hp感染和未感染胃细胞系中的动态表达,以探索ASH2L、ALPK1在调节Hp感染所诱导的ALPK1-TIFA激活的NF-κB信号通路中的作用。方法:1生物信息学分析ASH2L和ALPK1在胃腺癌中的表达及临床意义:利用TIMER2.0工具分析ASH2L、ALPK1在不同肿瘤组织中的表达水平Q-VD-Oph体内实验剂量;通过UALCAN平台分析ASH2L、ALPK1在胃腺癌中的差异表达及其与胃腺癌患者临床病理特征的相关性;用Kaplan-Meier plotter生存分析工具评估ASH2L、ALPK1对胃腺癌患者生存的影响;使用GEPIA工具分析胃腺癌中ASH2L与ALPK1的相关性;利用si RNA技术沉默ASH2L,经实时荧光定量PCR检测沉默ASH2L对ALPK1表达的影响;对课题组前期的m RNA转录组测序数据进行韦恩分析,探讨AGS细胞中沉默ASH2L对ALPK1表达量的影响以及Hp感染因素对ASH2L、ALPK1表达的影响。2分析ASH2L和ALPK1在Hp感染所致ALPK1-TIFA激活的NF-κB信号通路中的作用:(1)m RNA水平检测ASH2L和ALPK1的表达:在AGS和GES胃细胞系中分别感染pmss1(cag A~+)、pmss1(cag A~-)Hp菌株,同时分别用浓度为1ng/m L和10ng/m L的TNF-α处理以上两种细胞以作为NF-κB信号通路激活的阳性对照。制备感染和处理前后的RNA样品,利用实时荧光定量PCR技术从m RNA水平上检测6个不同感染时间点(0min、15min、30min、45min、60min和75min)细胞中ASH2L和ALPK1的相对表达量以及感染时间为60min时NF-κB信号通路靶基因A20、IκBα和TNF-α的相对表达量。(2)蛋白水平检测ASH2L和ALPK1的表达:在AGS和GES胃细胞系中分别感染43504(cag A~+)、pmss1(cag A~+)和pmss1(cag A~-)3株Hp菌株,同时分别用1ng/m L和10ng/m L的TNF-α处理两种细胞以作为NF-κB信号通路激活的阳性对照,制备感染和处理前后的蛋白样品。在Hp感染时间为60min时,以5个不同感染复数(0、10、50、100和200)处理细胞,使用Western blot技术检测ASH2L、ALPK1以及NF-κB信号通路相关蛋白分子P65、p-P65、IκBα及p-IκBα的表达水平。同样在感染复数为100时,用Western blot技术检测以上6个不同感染时间点细胞中上述蛋白的表达水平。(3)蛋白水平检测ALPK1-TIFA轴依赖的NF-κB信号通路的激活以及ASH2L和ALPK1的表达情况:在AGS胃细胞系中分别加入感染复数为100的pmss1(cag A~+)和pmss1(cag A~-)Hp菌株,同时用TNF-α处理AGS细胞以作为NF-κB信号通路激活的阳性对照。在感染60min后利用Western blot技术检测AGS细胞中ASH2L、ALPK1、P65、p-P65、TIFA和p-TIFA蛋白的表达情况。结果:1生物信息学分析结果(1)ASH2L和ALPK1基因在肿瘤组织中的差异表达分析:在56种常见肿瘤中,与癌旁正常组织相比,ASH2L在15种肿瘤中存在差异表达,ALPK1在15种肿瘤中存在差异表达(P<0.05)。(2)ASH2L和ALPK1基因与胃腺癌患者临床病理特征相关性分析:与正常胃组织相比,ASH2L和ALPK1基因在胃腺癌组织中均高表达;在胃腺癌中ASH2L基因的表达与患者的种族、年龄、病理分级、肿瘤分期、淋巴结转移及组织学亚型均相关,与男女性别不相关;ALPK1基因的表达与患者的年龄、病理分级、肿瘤分期、淋巴结转移及组织学亚型均相关,与种族和男女性别均不相关(P<0.05)。(3)ASH2L和ALPK1基因对胃腺癌患者生存影响的分析:ASH2L和ALPK1基因高表达者比低表达者有着更差的总生存期和后进展生存期(P<0.05)。(4)胃腺癌患者中ASH2L和ALPK1基因相关性分析:胃腺癌中,ASH2L和ALPK1基因的表达水平存在正相关关系(P<0.05)。(5)ASH2L表达下调对ALPK1表达量的影响:在AGS细胞中成功沉默了ASH2L基因,在ASH2L表达下调后,ALPK1的表达量也明显降低(P<0.05)。(6)对m RNA转录组测序数据的韦恩分析:在AGS细胞中沉默ASH2L后,ASH2L和ALPK1均为显著差异下调基因;在沉默了ASH2L基因的AGS细胞中加入Hp感染后,ASH2L和ALPK1基因下调已不再显著。2ASH2L和ALPK1在Hp感染所致ALPK1-TIFA激活的NF-κB信号通路中的作用(1)m RNA水平检测ASH2L和ALPK1的表达:在两种胃细胞系中,与未做处理组细胞相比,Hp感染实验组和TNF-α处理阳性对照组细胞中NF-κB信号通路靶基因A20、IκBα和TNF-α的表达量均显著上调(P<0.05);与pmss1(Cag A~-)感染组相比,pmss1(Cag A~+)感染组导致靶基因上调的幅度更显著(P<0.05)。与未作处理组细胞相比,在不同Hp菌株分别感染两种胃细胞系后,细胞中的ASH2L和ALPK1表达量均有随着感染时间的延长而逐渐上调的趋势。在AGS细胞中,以上6个不同感染时间条件下,pmsShort-term antibiotics1(cag A~+)感染组中ASH2L的表达量均高于pmss1(cag A~-)感染组(P<0.05);感染时间为60min和75min时,pmss1(cag A~+)感染组中ALPK1的表达量均高于pmss1(cag A~-)感染组(P<0.05);两种不同浓度TNF-α处理后的两种胃细胞系中ASH2L和ALPK1的表达量并没有随时间延长而出现明显变化。(2)蛋白水平检测ASH2L和ALPK1的表达:43504(cag A~+)、pmss1(cag A~+)和pmsCrizotinib供应商s1(cag A~-)3株Hp菌株感染AGS和GES胃细胞系后,细胞中ASH2L和ALPK1的表达量均有随着感染复数的增加或感染时间的延长而增加的趋势,P65的表达量无明显的变化趋势,IκBα的表达量呈下调趋势,而NF-κB信号通路激活的相关蛋白分子p-P65和p-IκBα的表达量呈明显上调趋势;在分别用两种不同浓度的TNF-α处理的两种胃细胞系中ASH2L和ALPK1表达量并没有随时间延长而出现明显的变化,p-P65和p-IκBα的表达量呈明显上调趋势。(3)蛋白水平检测ALPK1-TIFA轴依赖的NF-κB信号通路的激活以及ASH2L和ALPK1的表达:与未作处理的空白组相比,pmss1(cag A~+)和pmss1(cag A~-)两种Hp感染组中TIFA表达均有下调的趋势,p-TIFA和p-P65的表达量均有上调的趋势。结论:ASH2L和ALPK1基因有作为胃腺癌临床诊断、预后和治疗靶标的潜在价值,经初步分析表明ASH2L和ALPK1的表达量在胃腺癌细胞中呈现正相关关系。在Hp感染所致的NF-κB信号通路活化中ASH2L和ALPK1的表达量均随感染细菌量的增加和感染时间的延长而呈上升趋势,同时,p-P65、p-IκBα和p-TIFA、表达以及NF-κB信号通路靶基因A20、IκBα和TNF-α的表达量均显著上调,表明ALPK1-TIFA轴依赖的NF-κB信号通路被激活,而在TNF-α处理的细胞中则仅表现为ALPK1-TIFA轴依赖的NF-κB信号通路被激活,ASH2L和ALPK1的表达量并没有明显变化,说明这种ASH2L和ALPK1表达量的变化是Hp感染的结果。研究结果初步表明ASH2L与ALPK1在Hp感染所致的NF-κB信号通路活化过程中共同发挥着作用,但ASH2L与ALPK1是通过何种机制来共同影响NF-κB的活化,进而在Hp感染所致胃癌的发生发展中发挥作用等问题尚需进一步研究。