研究背景过敏性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)不仅影响患者的身体健康,还会引发睡眠障碍、工作学习效率降低等连锁反应。辅助性T细胞(helper T cell,Th细胞)免疫网络失衡是AR的发病基础。由于T细胞只能识别抗原呈递细胞加工处理后得到的抗原多肽,因此树突状细胞等抗原呈递细胞起到了重要作用。当树突状细胞失控时,会导致Th2细胞过度活化,诱发过敏性疾病。目前治疗AR的药物主要包括H1抗组胺药、鼻喷激素、肥大细胞稳定剂及减充血剂等,但因治疗周期较长、耐药率高等原因,新药亟待开发。巨噬细胞是一群可塑性及多样性极强的免疫细胞,在炎症、肿瘤等多种人体生理病理过程中发挥着重要作用。CD169+巨噬细胞不同于传统M1、M2型巨噬细胞,在调控淋巴细胞增殖、抗原呈递、调节免疫耐受和诱发炎症反应等方面发挥着重要作用。我们前期研究表明CD169+巨噬细胞在AR患者鼻黏膜上皮比例增高,且敲除AR小鼠模型中的CD169+巨噬细胞可抑制树突状细胞的活化。因此,CD169+巨噬细胞是否通过调控树突状细胞迁移诱导AR的发生是本课题研究重点。明确CD169+巨噬细胞在鼻黏膜中的表型及在AR发病过程中的作用机制,探索AR通路中的各类免疫细胞及细胞因子的生理变化将为AR的预防和治疗提供新的药物靶点。紫草素和重楼皂苷Ⅱ分别是由中药紫草和重楼提纯出的单体,有极大的药学价值,但因生物利用度低、保留时间短、溶解度差等生物活性限制了其临床应用。因此,为了更好地发挥紫草素和重楼皂苷Ⅱ对过敏性疾病的抗炎作用,高效的药物传递系统亟待开发。在我们对AR的研究过程中发现树突状细胞和中性粒细胞在AR动物的鼻黏膜中大量聚集并在过敏反应中起到了重要作用,因此是否可以利用可修饰的纳米颗粒装载中药单体,使其靶向树突状细胞或中性粒细胞,更好地发挥抗炎作用是本课题第二个研究重点,这将为AR的治疗提供新思路。研究目的利用白喉毒素受体转基因小鼠构建AR模型,Medical evaluation采用分子生物学实验、流式细胞术及代谢组学检测等技术,明确CD169+巨噬细胞在鼻腔黏膜中的表达情况,探索CD169+巨噬细胞在AR中的作用机制,研究CD169+巨噬细胞与树突状细胞等过敏反应相关免疫细胞及细胞因子之间的关系,发现AR疾病过程中的新靶点,构建新靶点相关的纳米药物并验证其治疗效果及作用机制,为AR的预防和治疗提供新思路。研究方法本课题从动物、细胞、分子水平探讨了 CD169+巨噬细胞在AR中的表达情况及调控免疫反应的机制。首先利用免疫荧光染色检测AR患者中CD169+巨噬细胞的表达情况,流式细胞学检测AR小鼠模型的鼻腔灌洗液中CD169+巨噬细胞的比例及成熟树突状细胞的比例。随后,我们利用白喉毒素受体转基因小鼠构建AR模型,取小鼠鼻腔灌洗液、脾脏、淋巴结检测CD169+巨噬细胞、树突状细胞、Th1、Th2、Th17和Treg细胞的比例,采用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术检测小鼠鼻腔灌洗液、外周血血清中IL-4、IL-17、IL-23、TGF-β和IFN-γ的浓度;HE染色检测嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润程度;代谢组学技术检测敲除CD169+巨噬细胞前后,小鼠鼻腔灌洗液代谢物的差异;细胞共培养体系、细胞划痕和Transwell实验检测丙氨酸通路对树突状细胞迁移性的影响。除此之外,还利用流式细胞学技术进一步探讨了先敲除CD169+巨噬细胞再致敏和先致敏再敲除CD169+巨噬细胞,哪种方式对AR相关炎症反应抑制效果更好,以及CD169+巨噬细胞敲除后的恢复时间。鉴于树突状细胞及中性粒细胞在AR中起到了重要作用,我们利用纳米合成技术构建了靶向树突状细胞(NGR-SHI-PM)及中性粒细胞(PLGA-5HT-PSII-Ce6)的纳米颗粒药物,并利用AR小鼠模GSKJ4纯度型的构建,结合ELISA、免疫荧光、免疫组化、Western blot、体外共培养技术、MTT等分子生物学技术分别探索了这两种药物治疗AR的作用机制。研究结果在CD169+巨噬细胞的研究中我们发现:(1)敲除CD169+巨噬细胞可抑制AR小鼠体内树突状细胞的成熟和迁移;(2)敲除CD169+巨噬细胞降低了 Th2、Th17细胞及相应免疫因子的表达;(3)敲除CD169+巨噬细胞提高了 Treg细胞的表达;(4)丙氨酸通路通过调控氧化应激在CD169+巨噬细胞调控树突状细胞诱导AR发生的过程中起到了“媒介”作用;(5)在动物模型中CD169+巨噬细胞被敲除后大概三个月可恢复;(6)先敲除CD169+巨噬细胞再致敏能更好地抑制AR的发生发展。在NGR修饰的紫草素纳米颗粒通过靶向树突状细胞治疗AR的机制研究中,结果发现:(1)NGR的修饰可增强树突状细胞对药物的内吞作用;(2)NGR的修饰增强了紫草素对AR小鼠树突状细胞、Th2细胞及相关炎症因子的抑制作用;(3)NGR-SHI-PM通过下调NF-κ B通路抑制AR的发生发展,而PARP是其中的靶点。在bis-5HT修饰的重楼皂苷Ⅱ纳米颗粒通过调控丙氨酸通路对中性粒细胞浸润的AR治疗作用的研究中,我们发现:(1)bis-5HT修饰可增强重楼皂苷Ⅱ对AR小鼠树突状细胞、Th2细胞的抑制作用;(2)bis-5HT修饰可增强重楼皂苷Ⅱ对AR小鼠过敏相关炎症因子的抑制作用;(3)丙氨酸通路在PLGA-5HT-PSⅡ-Ce6对中性粒细胞浸润的AR的治疗中起到重要作用。研究结论CD169+巨噬细胞可以通过丙氨酸通路调控树突状细胞迁移诱导AR的发生发展,NGR-SHI-PM可靶向树突状细胞,并调控树突状细胞中PARP基因下调NF-BAY 73-4506配制κ B通路抑制过敏性鼻炎;PLGA-5HT-PSII-Ce6可靶向中性粒细胞,并调控中性粒细胞中丙氨酸通路抑制中性粒细胞的氧化应激反应,从而对中性粒细胞浸润的过敏性鼻炎起到了治疗作用。