目的:研究胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)及CSE抑制剂金精三羧酸(Aurintricarboxylic acid,ATA)在三阴性乳腺癌中的耐药功能,探索诱发三阴性乳腺癌耐药的新型机制,为克服乳腺癌耐药,抑制复发转移、降低死亡率提供依据。方法:第一部分,研究CSE在三阴性乳腺癌细胞中的耐药功能与机制:采用qRT-PCR、Western blot检测不同系列乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞中CSE表达水平及P-gp的表达;应用MTS实验检测不同CSE表达水平的三阴性乳腺癌细胞对顺铂(DDP)和紫杉醇(PTX)的敏感性;采用LV-CSE-RNAi慢病毒下调人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中CSE的水平,并采用LV-CSE慢病毒上调BT549细胞中CSE的水平,通过MTS、EDU、细胞划痕、Transwell以及细胞凋亡实验检测细胞的生长、增殖、迁移、侵袭及凋亡,研究CSE表达水平对DDP和PTX敏感性的影响;采用Western blot、DHE染色及还原性谷胱甘肽(GSH)试剂盒,检测不同CSE表达水平对SIRT1-STAT3-C-myc-Bcl-2信号通路相关蛋白表达及细胞中GSH和ROS的水平的影响。第二部分,研究CSE抑制剂ATA在三阴性乳腺癌细胞中对DDP和PTX的增敏作用:采用细胞热转变分析实验(CETSA)、Western blot及亚甲基蓝实验检测在MDA-MB-231细胞中ATA与靶蛋白CSE的结合能力及ATA对CSE/H_2S体系的影响;采用MTS、EDU、细胞划痕,Transwell以及细胞凋亡实验检测ATA联合DDP或PTX后,对MDA-MB-231细胞的生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。第三部分,研究CSE抑制剂ATA在4T1小鼠移植瘤模型中对DDP和PTX的增敏作用:构建4T1小鼠移植瘤模型,待肿瘤体积约为50mm~3开始腹腔给药,给药剂量为:ATA组10 mg/kg/2day、DDP组1.5 mg/kg/2day、PTX组5 mg/kg/2day、ATA与DDP或PTX联合组、生理盐水组,记录瘤体积和小鼠体重变化;免疫组化分析肿瘤组织中Ki67的表达;HE染色检测小鼠给药后对五脏的影响。第四部分,探究CSE抑制剂ATA在三阴性乳腺癌中对化疗药物增敏作用的机制:采用Western blot检测ATA联合DDP或PTX后,对三阴性乳腺癌细胞和LXH254生产商动物肿瘤组织中SIRT1-STAT3-C-myGSK1349572分子式c-Bcl-2信号通路相关蛋白表达的影响;采用DHE染色及GSH试剂盒检测ATA联合DDP或PTX后对肿瘤细胞微环境中GSH和ROS水平的影响。结果:1、qRT-PCR及Western blot结果显示:与乳腺正常上皮细胞Hs578bst相比,CSE在乳腺癌细胞中高表达。2、Western blot结果显示:在不同系列乳腺癌细胞中P-gp蛋白的表达水平与CSE的表达呈正相关。3、MTS实验结果显示:CSE高表达的MDA-MB-231细胞对DDP和PTX的敏感性减弱。4、下调人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中CSE的表达水平可增强DDP和PTX对MDA-MB-231细胞生长、增殖、迁移、侵袭的抑制作用,并增强DDP和PTX对细胞凋亡的促进作用;上调人三阴性乳腺癌BT549细胞中CSE的表达水平可降低DDP和PTX对BT549细胞生长、增殖、迁移、侵袭的抑制作用。5、Western blot检测结果显示:当下调MDA-MB-231细胞中CSE的表达后,可促进SIRT1蛋白的表达,抑制AC-STAT3、STAT3、P-STAT3及STAT3下游Bcl-2、C-myc蛋白的表达,从而抑制SIRT1-STAT3-C-myc-Bcl-2信号通路;而上调BT549细胞中CSE的表达,则产生相反的结果。6、DHE染色及GSH检测结果显示:下调MDA-MB-231细胞中CSE的表达可抑制细胞中GSH的生成,诱导ROS的水平;而上调BT549细胞中CSE的表达可促进细胞中GSH的生成,抑制ROS的水平。7、CETSA、Western blot及亚甲基蓝实验结果显示:在MDA-MB-231细胞中ATA与靶蛋白CSE相结合并抑制CSE/H_2S体系。8、CSE抑制剂ATA可增强DDP和PTX对MDA-MB-231细胞生长、增殖、迁移和侵袭的抑制作用,但ATA对DDP和PTX促细胞凋亡作用无明显影响。9、体内实验结果显示:ATA可增强DDP和PTX对4T1小鼠移植瘤模型肿瘤生长的抑制作用;免疫组化结果显示,ATA可增强DDP和PTX对4T1小鼠移植瘤模型肿瘤组织Ki67表达的抑制作用;HE染色结果显示,4T1小鼠移植瘤模型给药期间无明显全身毒性。10、Western blot结果显示:ATA联合DDP或PTX可抑制MDA-MB-231细胞及肿瘤组织中CSE的表达,促进SIRT1蛋白的表达,抑制AC-STAT3、STAT3、P-STAT3及STAT3下游Bcl-2、C-myc蛋白的表达,从而抑制SIRT1-STAT3-C-myc-Bcl-2信号通路。11、DHE染色及GSH检测结果显示:ATA可增强DDP和PTX抑制MDA-MB-231细胞中GSH的生成,并且ATA联合DDP或PTX可促进ROS的水平,改变肿瘤细胞微环境。结论:1、CSE在人乳腺癌细胞中高表达,且CSE蛋白的表达与P-gp的表达呈正相关;CSE高表达的三阴性乳腺细胞对化疗药物的敏感性减弱。2、CSE/H_2S体系的激活可降低三阴性乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。3、CSE抑制剂ATA可增强三阴性乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。4、CSE抑制剂ATA可增强4T1小鼠移植瘤模型对化疗药物的敏感性perfusion bioreactor,且4T1小鼠移植瘤模型给药期间无明显全身毒性。5、改变CSE的表达水平可调控SIRT1-STAT3-C-myc-Bcl-2信号通路相关蛋白的表达,及肿瘤细胞微环境中GSH和ROS的水平,参与三阴性乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性的影响。