视网膜退行性病变(retinal degenerative diseases,RDD)是一组可导致视力损害乃至失明的疾病,严重影响患者的生活质量。视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是RDD最常见的疾病之一,其中感光细胞的进行性丢失是其典型的病理过程。由于视杆细胞和视锥细胞的逐渐丧失,RP患者通常在早期失去夜视能力,进而失去周边视力,最终失去中心视力。RP确切的发病机制尚不明确,世界各国的发病率约为1/4000,是世界上公认的最常见的严重致盲性眼病之一,且尚无有效治疗手段。干细胞移植因其能替代受损神经元,促进视功能恢复,为治疗RP带来了新的希望。目前,多项临床前实验和临床试验表明,干细胞移植对于治疗RP是安全且有效的,但干细胞治疗RP的潜在机制尚待阐明。Müller胶质细胞是视网膜中主要的大胶质细胞,贯穿整个视网膜,占视网膜所有胶质细胞的90%。作为视网膜的支持细胞,Müller细胞具有重要的生物学作用。在哺乳动物中,Müller细胞以多种方式对视网膜损伤做出反应。反应性Müller细胞可以通过释放神经营养因子和抗氧化剂保护组织功能。然而,Müller细胞过度增生也会通过形成胶质瘢痕促进视网膜变性,阻碍视网膜组织的再生过程。与哺乳动物截然不同,低等脊椎动物的视网膜在损伤过后可以通过Müller细胞重编程过程进行完全自发修复,Müller细胞也被视为内源性干细胞的重要来源,这为RP的治疗带来启迪。如病理状态下斑马鱼发生Müller细胞重编程时,Müller细胞从静止变为激活态,逆分化为前体细胞并转分化为视网膜神经元,从而修复受损的视网膜并实现视功能的恢复。但在高等哺乳动物体内,Müller细胞在视网膜受损后迅速发生胶质增生,对视网膜的修复能力更是微乎其微。因此,寻找促进哺乳动物Müller细胞重编程从而实现视网膜再生的策略是治疗RP的崭新路径。在特定条件下高等哺乳动物的Müller细胞重编程过程能被启动,Müller细胞可逆分化以及转分化为视网膜神经元。高等哺乳动物Müller细胞的重编程可以通过遗传学方法来启动,例如在Müller细胞中特异性过表达神经转录因子Ascl1或导入神经干细胞转化因子β-catenin和感光细胞分化因子(Otx2、Crx和Nrl)等。此外,注射外源性因子,如上皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)、FGF2和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF),证实促进了Müller细胞的逆分化并可转分化为视网膜神经元。值得注意的是,本团队和其他团队之前证明了外源干细胞移植也能够激发Müller细胞的视网膜内源性干细胞潜能,例如视网膜干细胞(retina stem cells,r SCs)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)、造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)等干细胞的移植。然而,干细胞移植对Müller细胞重编程的作用还需要进一步阐明。视网膜类器官技术为干细胞移植提供了新的治疗细胞来源。本实验室前期通过三维培养将人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)分化为视网膜类器官(h ESCs-derived retinal organoids,hERO),随后进行流式分选(C-Kit~+/SSEA4~-)获得种子细胞hERO-C-Kit~+/SSEA4~-RPCs(后称为retinal progenitor cells from human embryonic stem cells-derived retinal organoids,hERO-RPCs)。前期研究证实hERO-RPCs具有自我更新能力、多向分化潜能以及低成瘤风险,其移植后可保护变性鼠的视功能及移植区视网膜结构,并可调节视网膜变性微环境,抑制小胶质细胞过度活化和Müller细胞反应性胶质增生。Müller细胞反应性胶质增生和Müller细胞重编程是Müller细胞应对损伤时的不同反应。hERO-RPCs能否促进Müller细胞重编程尚不清楚,尚未见有关类器官来源视网膜祖细胞促进Müller细胞重编程的报道。基于文献报道和本实验室前期研究基础,本课题提出如下假设:hERO-RPCs移植到RCS大鼠的视网膜下腔,能抑制其视网膜Müller细胞的反应性胶质增生、促进其逆分化及转分化等重编程事件,从而对视网膜功能和结构发挥保护作用,延缓视网膜变性进展。针对上述假设,本文主要研究内容及研究结果如下:第一部分:hERO-RPCs视网膜下腔移植对RCS大鼠视网膜功能与结构影响的研究1.视网膜类器官采用h ESCs三维培养的手段获得,在培养至第30天时用于后续分离hERO-RPCs。通过流式细胞分选技术从培养30天的hERO分选出C-Kit~+/SSEA4~-细胞,培养至P3代,采用细胞免疫荧光技术对其进寻找更多行视网膜祖细胞和细胞增殖标记的鉴定。本研究观察到,P3代hERO-RPCs大小不等且形态多样,大多呈梭形,且hERO-RPCs表达视网膜祖细胞标记物和细胞增殖标记物。表明通过细胞表面标记联合筛选,本研究从视网膜类器官成功分离出了hERO-RPCs,可用于后续进行移植及离体实验。2.本研究使用慢病毒将hERO-RPCs转染标记EGFP,随后进行Rfunctional biologyCS大鼠视网膜下腔移植,设空白组和PBS组为对照组,通过闪光视网膜电图(flash electroretinogram,f ERG)检测RCS大鼠移植后视功能的改善情况。结果显示,hERO-RPCs移植后4周f ERG a波幅值较对照组显著提高。移植后4、8周,f ERG的b波的幅值较对照组也显著性提高,提示hERO-RPCs移植对RCS大鼠的视功能具有保护作用。3.本研究通过免疫荧光技术鉴定移植细胞的人源特性并评估移植细胞的存活和迁移情况。结果显示,移植后8周,EGFP~+细胞与人特异性抗体MTCO2和Hu Nu共表达,证明EGFP~+细胞为人来源,hERO-RPCs可在宿主视网膜及视网膜下腔存活良好。移植后2周,观察到移植细胞位于视网膜下腔及视网膜外核层。移植后4周,移植细胞纵向迁移可至视网膜内核层,最远到达节细胞层。移植后8周,移植细胞纵向迁移可均匀分布至视网膜各层,表明其具有良好的迁移能力。本研究通过外核层厚度来分析移植后视网膜结构的保护情况。结果显示,随着变性的进展,RCS大鼠视网膜的外核层持续变薄。移植后2、4、8周,移植区组的外核层厚度显著性大于对照组。此外,对移植对侧区组外核层厚度进行分析,发现移植后2、4周移植对侧区组外核层厚度也较对照组显著性增加,但保护作用弱于移植区组。结果表明,hERO-RPCs移植早期和中后期可促进移植区和对侧区视网膜结构保护,延缓视网膜变性。第二部分:hERO-RPCs视网膜下腔移植对RCS大鼠Müller细胞重编程的研究1.通过免疫荧光分析hERO-RPCs移植后Müller细胞胶质化的改变。本研究发现,移植后2周,移植区组和PBS组胶质化指标GFAP的平均荧光强度显著高于未处理组和对侧区组。移植后4、8周,移植区组GFAP的平均荧光强度较对照组显著降低,且GFAP~+细胞的突起变细并变短,但对侧区组GFAP表达未被抑制。结果提示,hERO-RPCs在移植中后期能抑制移植区Müller细胞的胶质化。2.通过免疫荧光分析hERO-RPCs移植对Müller细胞逆分化的影响。研究发现,移植后2、4、8周,与对照组相比,移植区组及对侧区组Sox9~+Müller细胞数量显著增多。在对照组中,大部分Sox9~+细胞位于内核层上部,但在移植区组中,Sox9~+细胞向外核层方向迁移,少量细胞进入外核层。移植后2、4、8周,移植区组Sox9~+细胞的垂直分布距离较对照组显著增加。移植后2、4周,移植对侧区组Sox9~+细胞的垂直分布距离也较对照组显著增加。此外,免疫荧光识别逆分化相关转录因子Chx10、Müller细胞标记Vimentin和Sox9,在移植后2、4、8周,移植区组Chx10~+细胞、Vimentin~+/Chx10~+细胞和Sox9~+/Chx10~+细胞的数量较对照组显著增加。移植后4、8周,移植对侧区组Chx10~+细胞较对照组显著增加,仅在移植后8周,移植对侧区组Vimentin~+/Chx10~+细胞较对照组显著增加。以上结果提示,hERO-RPCs移植促进移植区及对侧区Müller细胞的数量增加、迁移及逆分化转录因子表达,提示Müller细胞可能发生早期逆分化。3.通过免疫荧光分析hERO-RPCs移植对Müller细胞转分化的影响。移植后8周,本研究未发现Sox9~+Müller细胞与视网膜感光细胞标记物Rhodopsin、神经节细胞标记物Brn3a、神经节/无长突细胞标记物Hu C/D及感光前体标记物Crx共标。提示:hERO-RPCs在移植8周时未促进Müller细胞转分化。第三部分:hERO-RPCs对Müller细胞重编程机制的初步研究1.通过hERO-RPCs与原代LE大鼠Müller细胞进行体外Transwell间接共培养实验,设Müller细胞单独培养组为对照组,采用细胞免疫荧光技术分析共培养后Müller细胞增殖能力的变化。原代细胞传至P3代,细胞形态较为稳定,呈大胞体多突起,突起可交织成网状,纯度较高且增殖活性良好。本研究观察到,在共培养后1、3、5天,实验组Müller细胞数量和Ki67~+细胞比例显著高于对照组,提示体外hERO-RPCs可以促进Müller细胞的增殖。2.通过hERO-RPCs与原代Müller细胞进行细胞迁移实验,设Müller细胞单独培养组为对照组,分析体selleck激酶抑制剂外hERO-RPCs对Müller细胞迁移能力的影响。结果显示,在培养后24小时,实验组结晶紫染色较对照组增多,统计显示实验组迁移的Müller细胞数量较对照组显著增多,提示在体外hERO-RPCs对Müller细胞的迁移具有促进作用。3.采用细胞免疫荧光技术分析共培养后Müller细胞胶质特性和前体特性相关蛋白的改变,采用Real-Time PCR分析共培养后Müller细胞胶质特性和前体特性m RNA表达的改变。本研究发现hERO-RPCs与Müller细胞共培养后Müller细胞胶质特性与前体特性相关蛋白的表达无明显差异。但与hERO-RPCs共培养后1、3天,实验组Müller细胞胶质特性m RNA表达下调,前体特性m RNA表达上调,提示在体外hERO-RPCs可以在转录层面抑制Müller细胞胶质化并促进其重编程中的逆分化事件。综上所述,本课题得出以下研究结论:1.本研究发现,hERO-RPCs移植RCS大鼠后存活和迁移状态良好,可保护RCS大鼠的视功能,并促进移植早期及中晚期移植区和对侧区视网膜结构的保护,延缓视网膜变性。2.本研究首次发现,hERO-RPCs移植仅抑制移植区Müller细胞胶质化在移植中晚期,促进了移植区及对侧区Müller细胞的数量增多、迁移及逆分化相关转录因子的表达,但未观察到转分化指标表达,提示hERO-RPCs移植促进了Müller细胞早期逆分化,但未促使Müller细胞发生转分化。3.率先对hERO-RPCs影响Müller细胞重编程的机制进行了初步研究,提示在体外hERO-RPCs可促进Müller细胞的增殖和迁移,并可下调其胶质特性m RNA的表达和上调其前体特性m RNA的表达,表明在体外hERO-RPCs可以在转录层面抑制Müller细胞胶质化并促进其重编程。