目的急性肺损伤(ALI)由多种损伤因素引起,已证实炎症反应和细胞铁死亡密切相关。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)在炎症反应中发挥重要作用,也是铁死亡的核心调控蛋白,因此上调GPX4有助于抑制细胞铁死亡和炎症反应,有望有效治疗ALI本论文设计构建了负载p GPX4的甘露醇修饰聚乙烯亚胺(m PEI)基因治疗系统mPEI/pGPX4纳米粒,可通过吸入给药方式到达小鼠肺部,内吞入胞后p GPX4质粒释放并表达GPX4,发挥抑制细胞铁死亡和抗炎作用,从而达到治疗ALI的目的。方法1.以L-半胱氨酸、D-甘露糖为原料,设计合成含有甘露醇基团的中间产物Man-Cys。将聚乙烯亚胺(PEI)与SPDP连接后与上述中间产物反应得到甘露醇修饰的聚乙烯亚胺目标产物m PEI。使用1H NMR和FT-IR对目标产物进行结构表征。通过静电结合作用将m PEI和p GPX4以不同质量比复合制备mPEI/pGPX4纳米基因递送系统。使用纳米激光粒度测定仪测定mPEI/pGPX4纳米粒的粒径、PDI、Zeta电位;观察mPEI/pGPX4纳米基因递送系统在水和PBS中放置的稳定性;通过扫描电镜对纳米粒进行形态学表征;使用透射电镜对mPEI/pGPX4纳米粒表面元素进行mapping分析;通过琼脂糖凝胶电泳法对制备Dinaciclib纯度的mPEI/pGPX4纳米基因递送系统的基因Medical range of services负载和保护能力进行研究。2.采用溶血试验检测mPEI/pGPX4纳米基因递送系统的生物相容性;通过western-blot检测mPEI/pGPX4纳米粒转染表达GPX4蛋白情况;通过荧光显微镜考察转染过程中纳米粒的内吞机制。通过激光共聚焦和流式细胞术观察了mPEI/pGPX4纳米粒对LPS诱导损伤的人支气管肺上皮细胞(BEAS-2B)内ROS和脂质过氧化水平的变化情况;通过western-blot检测铁死亡关键蛋白的表达情况;通过透射电镜观察细胞的线粒体形态变化;通过实时定量PCR测定细胞中IL-6、IL-β和TNF-α的m RNA水平,考察mPEI/pGPX4纳米粒对LPS诱导损伤的BEABlebbistatin抑制剂S-2B细胞炎症水平的影响。3.使用BALB/c小鼠给予LPS(脂多糖)建立急性肺损伤模型,评价mPEI/pGPX4治疗ALI的效果;采用H&E染色评价小鼠肺组织的病理变化情况;通过ELISA检测试剂盒检测了血清、肺组织和肺泡灌洗液中炎症因子的变化情况;采用免疫荧光和Western-blot检测肺组织中铁死亡关键蛋白表达情况;使用MDA和GSH试剂盒测定肺组织中MDA和GSH的变化情况;采用荧光显微镜观察肺组织中ROS的水平;通过透射电镜观察肺组织中的线粒体形态变化;通过小鼠各脏器指数以及小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)水平变化情况评价mPEI/pGPX4纳米基因递送系统的体内安全性;通过H&E染色进一步考察吸入给药后各治疗组对正常小鼠肺部的影响。结果1.~1H NMR和IR证实了合成产物为目标化合物m PEI,得到了平均粒径为143nm,电位为28.2 m V的mPEI/pGPX4纳米粒,并且mPEI/pGPX4纳米粒在水中和PBS中的粒径和PDI无明显变化,说明具有良好的存储稳定性。扫描电镜结果显示,纳米粒形状规则,均一性好。通过透射电镜mapping分析结果也进一步表明,纳米粒元素组成与目标纳米粒一致。2.凝胶电泳实验结果表明,该纳米粒在质量比大于1:1(m PEI:p GPX4)时,未出现明显p GPX4条带,表明所构建基因递送载体m PEI具有良好的基因负载能力。在DNaseⅠ核酸酶条件下,纳米粒能有效保护DNA不被降解,而裸的DNA在同样条件下易被降解,表明纳米粒具有很好的基因保护能力。Western-blot实验结果显示,与空白质粒NC相比,mPEI/pGPX4纳米粒可以有效实现p GPX4的转染,表达GPX4蛋白,表明mPEI/pGPX4纳米粒具有很好的基因转染活性。3.溶血试验结果表明,mPEI/pGPX4纳米粒的溶血率小于5%,具有良好的生物相容性。纳米粒入胞机制研究表明,与商品化基因转染载体支化PEI 25k负载的PEI/p GPX4纳米粒相比,经甘露醇修饰的mPEI/pGPX4纳米粒可增强小窝介导的细胞摄取,一定程度避免溶酶体/内含体对纳米粒的捕获,有利于转染活性的提高。4.体外细胞实验研究表明,与LPS诱导的损伤模型组相比,PEI/p GPX4纳米粒和mPEI/pGPX4纳米粒均能促进GPX4蛋白的表达;减轻LPS引起的BEAS-2B细胞ROS和脂质过氧化的产生;改善线粒体变小、膜密度增高的形态学特征,有效抑制铁死亡;降低IL-6、IL-β和TNF-α的m RNA水平,显示良好的抗炎作用。其中mPEI/pGPX4纳米粒表现出更好的抗炎和抑制铁死亡作用。5.体内实验研究进一步表明,与LPS诱导的损伤模型组相比,PEI/p GPX4纳米粒和mPEI/pGPX4纳米粒均可减少ROS、MDA的产生,提升GSH的水平;明显增加GPX4、SLC7A11蛋白表达;减轻细胞铁死亡引起的线粒体变小、膜密度增高等形态学变化。此外,PEI/p GPX4纳米粒和mPEI/pGPX4纳米粒还能减少IL-6、IL-β和TNF-α促炎细胞因子的产生;减少损伤肺组织的溶血和细胞浸润。因此PEI/p GPX4和mPEI/pGPX4纳米粒可通过抑制铁死亡和抗炎双重作用治疗急性肺损伤,而mPEI/pGPX4纳米粒表现出更好的治疗效果。小鼠主要器官脏器指数和肝肾功能测定结果也表明,mPEI/pGPX4纳米粒具有良好的体内安全性。H&E染色进一步考察了吸入给药后正常小鼠肺部损伤情况,mPEI/pGPX4纳米粒组小鼠肺组织完整清晰,肺泡壁薄,无出血点,肺泡腔细胞无炎症浸润和渗出,胶原沉积较少,说明mPEI/pGPX4纳米粒吸入给药具有良好的体内安全性。结论本论文以商品化基因转染载体PEI为骨架材料,合成得到经甘露醇基团修饰的m PEI,并与p GPX4质粒通过静电作用得到mPEI/pGPX4纳米基因递送系统。mPEI/pGPX4纳米粒可通过甘露醇诱导增强小窝介导的内吞,从而提高了递送系统的体内外基因转染效率。所构建的mPEI/pGPX4纳米粒通过吸入给药后到达小鼠肺部,通过小窝介导的内吞作用入胞,释放p GPX4并高效表达GPX4,通过抑制细胞铁死亡和抗炎作用达到有效治疗ALI的目的。上述研究结果表明,经甘露醇基团修饰的mPEI/pGPX4纳米基因递送系统是一种有效治疗ALI的策略,可为ALI的临床治疗提供理论与实验支持。