PDK1信号通路

目的：探讨对患白内障合并青光眼的老JQ1体外年biohybrid system患者手术治疗同时给予睡眠诱导干预联合健康教育对提高睡眠质量的作用。方selleck法：选取2021年1月至2021年12月寿光市人民医院收治的白内障合并青光眼并进行手术治疗的老年患者90例作为研究对象，按照随机数字表法分为对照组和观察组，每组45例。对照组进行常规护理，观察组予以睡眠诱导干预联合健康教育，比较2组焦虑/抑郁自评量表(SAS/SDS)评分与匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)以及并发症率。结果：干预后观察组SAS为(38.26±4.70)分，SDS为(36.29±3.87)分，均低于对照组；观察组PSQI指数入睡时间(0.62±0.23)分，睡眠效率(0.72±0.31)分，睡眠时间(0.68±0.26)分，睡眠障碍(0.62±0.22)分，催眠药物(0.58±0.25)分，日间障碍(0.62±0.21)分，睡眠质量(0.69±0.20)分，均低于对照组；观察组并发症率2.22%,低于对照组17.78%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：对老年白内障合并青光眼手术患者采用睡眠诱导干预联合健康教育能改善患者负性情绪及睡眠质量，可降低并发症风险。

目的 探讨外周血中性粒细胞与血小板计数比值(NPR)对呼吸衰竭患者预后的评估价值。方法 选取2017年1月至2022年6月在上海市浦东新区浦南医院呼吸科住院的呼吸衰竭患者180例，根据28 d生存情况分为生存组(132例)和死亡组(48例),入院时测定血常规[中性粒细胞N、血小板计数(PLT)]、血浆降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素photobiomodulation (PBM)(IL)-6、IL-8、动脉血气、血生化、计算氧合指数、急性生理与慢性健康评估(APACHE)Ⅱ评分。比较两组临床资料，采用Cox比例风险回归模型分析影响预后的因素，采用Spearman进行相关性分析，采用受试者工作特征(ROC)曲线评估NPR对呼吸衰竭患者死亡率的预测价值。结果 死亡Adavosertib组PLT、pH值、动脉血氧分压、氧合指数均显著低于存活组，NPR、PCT、CRP、IL-6、IL-8、动脉血二氧化碳分压(PaCO_2)、动脉血乳酸、APACHEⅡ评分均显著高于存活组(均P<0.05)。Cox比例回归风险分析显示，低血小板、高NPR、血浆高PCT、低动脉血氧分压、低氧合指数、高APACHEⅡ评分是影响呼吸衰竭患者的独立危险因素(P<0.05)。Spearman相关性分析显示，呼吸衰竭患者的NPR与血浆PCT、CRP、IL-6、IL-8、PaCO_2、动脉血乳酸、APACHEⅡ均呈显著正相关，与PLT、pH值、动脉血氧分压、氧合指数均呈显著负相关(均P<0.05)。ROC曲线分析显示，NPR预测呼吸衰竭患者28 d死亡率的曲线下面积(AUC)是0.784,最显著佳截断点0.076,灵敏度81.5%,特异度65.3%。结论 GDC-0973外周血NPR升高是呼吸衰竭患者预后的独立危险因素，具有较好的预后评估。

目的:评估基于术前T1CE的临床-影像组学模型对成人弥漫性胶质瘤IDH1状态的预测价值。方法:回顾性纳入了来源于中国医科大学附属第一医院2013年01月至2022年08月间经病理证实的成人弥漫性胶质瘤患者154例,其中77PS-341例为IDH1突变型,77例为IDH1野生型,用随机分层抽样按7:3的比例将患者分为训练集(107例)及验证集(47例)。所有患者均有完整的术前常规(包括T1WI、T2WI、FLAIR、T1CE序列)核磁共振图像,通过ITK-SNAP软件将T1CE图像配准到T2WI图像上,然后在T2WI图像上逐层勾画感兴趣区(包括肿瘤实质及瘤周水肿),最后将T2WI图像中的ROI复制到配准后的T1CE图像。通过A.K软件进行特征提取,剔除相关性>0.7,单因素逻辑回归p<0.1,采用梯度提升决策树(GBDT)方法进行特征筛选,随后建立多因素Logistic回归模型,通过单独影像组学特征和联合不同临床特征构建了三种预测模型:(1)单独影像组学(Radscore)模型;(2)Radscore+年龄的联合模型;(3)Radscore+年龄+位置的临床-影像组学联合模型。各模型对成人弥漫性胶质瘤IDH1表达状态的预测效能的评价通过受试者工作特征曲线(ROC)评价。非正态分布的连续变量采用Mann-Whitney U检验,分类变量采用卡方检验,对患者的年龄、性别、机器分类、肿瘤位置等临床资料以及各模型所选特征在IDH1突变组和IDH1野生组间的差异性进行统计学分析,p值<0.05认为有统计学意义。结果:IDH1突变组与IDH1野生组之间在机器分类、性别方面均无统计学差异,在年龄、肿瘤位置方面具有统计学意义。从T1CE图像中提取了1319个影像特征,经过特征筛选后最终得到了12个最显著的特征。对所选特征进行IDH1突变组和IDH1野生组的组间比较,通过ROC曲线来评估模型的预测效能。并且对构建的三个模型进行了比较,训练集中单独Radscore、RadscoreRSL3+年龄、Radscormedical humanitiese+年龄+位置三个模型的AUC值分别为0.868、0.877、0.923,因此,Radscore+年龄+位置的临床-影像组学模型更优。结论:本研究表明基于术前T1CE的临床-影像组学模型可有效且无创地对成人弥漫性胶质瘤IDH1状态进行初步预测,有望为成人弥漫性胶质瘤患者的预后提供一定的临床参考价值。

《中国心血管病报告2020》显示,我国心血管病患病率及死亡率不断攀升,已经成为夺走国人性命的头号杀手,临床运用经皮冠脉介入术(percutaneous c oron-ary intervention,PCI)和药物溶栓等再灌注疗法改善心肌缺血造成的不可逆心肌损伤疗效显著。但真实世界研究表明,再灌注治疗是一把双刃剑,再灌注后缺血区心肌在血流重新供应后会加重心肌损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI),其后期导致的心力衰竭及相关并发症、病死率不断攀升,寻找有效干预MIRI损伤的方法为亟待解决的临床难题。基础实验研究表明,心肌缺血再灌注损伤是多种复杂经典机制共同调控的疾病发生过程,其中炎症是心脏缺血再灌注损伤过程中最早出现的反应之一,细胞坏死是心肌缺血再灌注损伤中的经典途径,两者互为因果、相互伴行。铁死亡是依赖铁离子积累及脂质过氧化发生的调节性死亡,其关键影响脂肪酸代谢,酰基辅酶 a 合成酶长链家族成员 4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)是一种参与脂肪酸代谢的酶,研究证明其为铁死亡的特殊生物标志物,其过表达会导致铁死亡。细胞死亡后释放损伤相关分子模式,干预TLR4表达进而激活转录因子NF-κB,诱发免疫炎症反应加剧心肌损伤。心肌缺血再灌注损伤中铁死亡与免疫炎症反应密切相关,但可能的协同作用机制并不明确。导师基于多年的临床实践认为:冠心病进展的病机关键为“热结血脉”,即“热邪”与血脉中的“瘀血痰湿”等有形之物相互搏结,治疗当以清热解毒、活血散结,并据此创研代表方剂金玄安脉(别名:HJ11)。医家认为中医热的概念包括西医炎症反应,“热结血脉”的生物学基础可能与心脑血管中发生的炎症过程密切相关。为探求“热结血脉”的生物学基础及HJ11治疗缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)心肌损伤的可能作用机制,本研究拟从免疫炎症反应、铁死亡及两者作用关系展开实验,以期为冠心病的临床诊疗提供新的思路。研究目的1.明确临床效验方HJ11治疗冠心病的疗效,通过制备大鼠缺血再灌注模型,使用HJ11方进行干预,考察HJ11对缺血再灌注模型大鼠血清学指标及病理学的影响。2.明确HJ11方改善大鼠缺血再灌注心肌损伤的可能作用机制,探索HJ11对铁死亡及免疫炎症反应的影响。研究方法1.采用心动超声、ELISA检测血清学指标及组织染色观察HJ11对于I/R大鼠心肌损伤的改善作用。制备SD大鼠心脏缺血再灌注模型,心动通过超声的射血分数及室壁运动指标、心肌酶LDH、CK-MB作为模型评估指标,通过组织染色观察心肌形态结构改变、TTC观察心肌白色梗死面积、Tunel染色观察I/R大鼠心肌改变。2.采用ELISA及流式分选检测炎症因子的表达、相关免疫细胞亚型的比例,以明确HJ11对于I/R大鼠炎症反应的调节作用。利用ELISA检测I/R大鼠心脏组织匀浆中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,通过流式细胞术检测大鼠血清中性粒、单核细胞各亚型的比例。3.采用ELISA、组织染色、透射电镜及蛋白免疫印迹实验明确HJ11对于I/R大鼠铁死亡的干预作用。通过ELISA法检测大鼠血清及心脏组织中亚铁离子的表达;采用普鲁士蓝染色检测心脏组织中铁离子的沉积;通过透射电镜观察心肌组织中线粒体的结构改变,通过蛋白免疫印迹实验检测铁死亡相关蛋白的表达。4.采用小干扰RNA技术及转染过表达质粒方法探索HJ11对于改善I/R大鼠心肌损伤的可能作用机制。制备H9c2缺血再灌注的细胞(OGCR)模型,通过转染小干扰RNA及过表达质粒干扰H9c2细胞中ACSL4的表达。通过EL ISA观察细胞培养上清中炎症因子的表达,通过激光共聚焦观察转录因子NF-κB的核转移情况,通过蛋白免疫印迹法检测心肌细胞中TLR4/MyD88/NFκB及其下游信号分子的表达。研究结果1.HJ11可改善I/R大鼠心肌损伤。心动超声可见I/R组左心室射血分数降低至30.67±5.55%,使用Aspirin、HJ11干预后可见射血分数增加,Aspirin组射血分数增加至47.77±10.28%,中、高剂量组较低剂量组改善效果更为明显,高剂量组射血分数增加至45.23±5.03%(p<0.05),有效改善了大鼠心脏缺血再灌注后的心脏功能;心肌酶指标结果显示,I/R组较Sham组大鼠血清中LDH、CK-MB表达增加,使用HJ11干预后可降低大鼠缺血再灌注后LDH、CK-B的表达且同阳性对照药Aspirin组效果无异;TTC染色结果显示I/R组较假手术组的白色梗死面积增AM-2282使用方法加,为43.74±27.19%(p<0.05),Aspirin、HJ11干预后可见明显的白色梗死面积减少,其中HJ11-H组的效果最为明显,可见白色梗死面积减少至23.85±0.02%,说明HJ11可减少大鼠心肌缺血再灌注后造成的心肌梗死面积(p<0.05);本部分结果表明模型制备成功且HJ11干预效果和Aspirin干预效果一致。HE结果可见HJ11可改善I/R大鼠的心肌组织结构改变并减少炎性细胞浸润;TUNEL染色结果显示I/R组较假手术组凋亡细胞明显增多,I/R组凋亡细胞阳性率高达53.86±6.78%,使用HJ11干预后可见凋亡细胞减少,HJ11-H组改善效果最为明显,阳性细胞率可降低至18.4-4±5.17%(P<0.01),说明HJ11可减轻大鼠缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。2.HJ11可减轻I/R大鼠炎症反应。ELISA检测结果显示,I/R组各炎症因子较假手术组TNF-α、IL-6、IL-1β表达增加2-3倍,其中I/R组心脏组织TNF-α的表达高达 99.11±5.53、IL-6 为 64.60±5.30、IL-1β为 81.75±10.58,使用 HJ11干预可降低大鼠心肌组织匀浆中炎症因子的表达,且呈现剂量依赖性下调,HJ11-H组较I/R组炎症因子TNF-α的表达降低,TNF-α降低为56.19±16.58(P<0.01)、IL-6 为 38.58±9.37、IL-1β为 33.64±8.51(P<0.01),说明 HJ11可有效降低各炎症因子的表达(P<0.01);流式细胞术检测结果显示,HJ11对大鼠I/RI/R的中性粒细胞及单核细胞的调节呈现不同的趋势,I/R组较假手术组可见中性粒细胞表达增加(P<0.01);单核细胞总比率表达降低,其中I/R组较假手术组的单核细胞促炎症亚型表达增加(P<0.05)、抑炎症表型表达降低(P<0.05)。ELISA及流式细胞分选结果说明HJ11对于大鼠心脏缺血再灌注后的炎症反应有很好的抑制作用;透视电镜观察心肌细胞细微结构,可见HJ11可改善大鼠心肌缺血再灌注损伤后的线粒体结构,减轻线粒体收缩、线粒体嵴断裂。3.HJ11可干预I/R大鼠铁死亡。ROS结果示,I/R组较假手术组ROS表达增加,I/R组ROS表达可至145.3±5.86,是假手术组表达量47.00±4.00的3倍(P<0.01),HJ11干预后可见ROS降低,HJ11-此网站H组效果更为显著,可降低至102.70±5.69(P<0.01),说明HJ11可明显降低ROS的积累。MDA及SOD结果可见,HJ11可降低大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌组织中MDA的表达,增加大鼠心肌组织SOD及GSH的表达(P<0.05);ELISA检测大鼠血清及心肌组织中亚铁离子的表达,I/R组较假手术组呈现明显的增加,HJ11可呈剂量依赖性的抑制铁离子的沉积(P<0.01),普鲁士蓝染色结果也可见I/R组较正常组蓝染铁离子增加,HJ11干预后可见蓝染面积减少(P<0.05);Western blot检测大鼠心肌组织中铁死亡关键蛋白的表达,发现HJ11可下调ACSL4、COX2的表达,增加GPX4、FTH-1的蛋白表达。4.HJ11对于改善I/R大鼠心肌损伤的可能作用机制。H9c2大鼠心肌细胞系重复体内研究的结果,发现HJ11可有效降低H9c2细胞OGD/R后的氧化应激损伤,并且可以呈现剂量依赖性的减少铁离子的沉积,活性氧的累积,提高H9c2细胞活力,改善OGD/R后biopolymer gels的心肌损伤;ATP及mtDNA结果可说明,HJ11可以影响心肌细胞的能量代谢,增加ATP、mtDNA含量(P<0.05);透视电镜进一步观察H9c2细胞细微结构可见,HJ11也可改善OGD/R造成的线粒体的结构损伤,减轻线粒体收缩;Western blot结果可见HJ11可上调铁死亡关键蛋白GPX4、FTH-1的蛋白表达(P<0.05),降低ACSL4、COX2的表达(P<0.05),在心肌细胞OGD/R损伤中HJ11依然可发挥抑制铁死亡的作用;在OGD/R处理的H9c2细胞中ACSL4的敲除减轻了铁的积累、氧化应激和铁死亡;通过转染过表达ACSL4质粒逆转了 HJ11对OGD/R触发的铁沉积的抑制作用;增加了铁死亡诱导剂及抑制剂组,结果发现HJ11可发挥和铁死亡抑制剂效率相近的抑炎效果,并且观察加入铁死亡诱导剂组,炎症因子较HJ11组明显上调(P<0.05);共聚焦结果可见OGD/R组胞核内较胞浆内的NF-κB增加,使用HJ11干预后可逆转NF-κB入核增多的现象;蛋白免疫印迹实验结果可见OGD/R组较正常组TLR4、MyD88及TRAF6蛋白表达上调,胞浆内NF-κB减少,胞核内NF-κB增加,并且伴随P65的磷酸化增加(P<0.05),P-P65表达上调;IKBα表达未有明显变化,但是磷酸化的IKBα上调明显(P<0.05);使用HJ11干预后可见TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达较OGD/R组降低,胞浆内NF-κB增加,胞核内NF-κB降低,并且伴随P65的磷酸化减少(P<0.05),P-P65表达下调;IKBα表达未有明显变化,但是磷酸化的IKBα减少明显(P<0.05)。加入铁死亡诱导剂Eartin后可逆转HJ11对上述蛋白表达的影响,而HJ11干预组和铁死亡抑制剂组Fer-1对于蛋白表达调控的作用基本相同,说明HJ11可发挥铁死亡抑制剂效果,通过降低转录因子NF-κB的激活、调节TLR4/MyD88/NFκB信号通路蛋白表达发挥减轻炎症反应的作用。研究结论1 HJ11可减轻大鼠心肌缺血再灌注造成的心肌细胞病理损伤、改善缺血再灌注损伤后的心肌功能、减少心肌梗死面积的扩大,并降低心肌细胞凋亡;2 HJ11可减轻心肌缺血再灌注后的炎症因子的释放,并降低中性粒细胞、单核细胞促炎症表型的比例,改善炎症反应带来的心肌损伤;3 HJ11方减少I/R损伤后的铁离子沉积,减轻铁死亡,改善缺血再灌注造成的氧化应激损伤;4HJ11发挥铁死亡抑制剂的作用调控铁死亡关键蛋白ACSL4的表达干预铁死亡的发生发展,并且可以调节炎症反应关键信号通路TLR4/MyD88/NF-κB的表达变化,降低心肌细胞缺血再灌注损伤中的炎症因子的释放,降低炎症反应带来的心肌损伤,总之,HJ11可通过调节ACSL4介导的铁死亡及TLR4/MyD88/NF-κB 抑制心肌 I/R 损伤。

对高温热水预处理后的芦苇和玉米秸秆生物转化为燃料乙醇进行了研究。对不同高温热水预Mediating effect处理过程中原料的化学组分进行对比分析,主要分析了乙醇抽出物、聚戊糖含量、葡聚糖含量、酸不溶木素含量、酸溶木素含量及灰分含量的变化,旨在找出在预水解液多次循环过程中各化学成分的变化情况。在多次循环预水解液的预处理过程中,随着循环次数的增加,芦苇和玉米秸秆不溶性固体中木聚糖含量均无明显变化;排除一些实验误差造成的数据误差,乙醇抽出物、酸不溶木素基本随着循环次数的增加先上升后下降的趋势;而酸溶木素和葡聚糖则是呈Ceralasertib细胞培养先上升后变平稳的状态;灰分则呈上升趋势。芦苇随着循环次数Gefitinib-based PROTAC 3体外的增加乙醇发酵的浓度出现先增加后减小的趋势。而玉米秸秆正好相反,玉米秸秆最高乙醇发酵质量浓度达35 g/L,而芦苇高达45 g/L。

琼脂糖是多糖类层析介质中应用最广的一种,具有良好的亲水性、生物相容性且分子上富含羟基,在生物大分子的分离纯化中有重要作用。其Thai medicinal plants中,以琼脂糖微球作为基质的金属螯合亲和层析介质应用广泛,通过螯合的过渡金属离子与蛋白质表面的一些氨基酸发生特殊的相互作用,形成的稳定螯合物能够使蛋白质高效Pevonedistat溶解度快速地分离。国产琼脂糖微球层析介质产品由于机械强度不高、蛋白载量低下,国内市场目前被几家海外供应商垄断。因此,探究琼脂糖微球的制备、交联以及配基连接方式对研发国产化的高载量层析介质具有重要的意义。目前工业化生产琼脂糖微球以机械搅拌法为主,然而该法存在微球粒径不均一、尺寸难控、油相和乳化剂用量大等问题,成本较高。本文以适应琼脂糖微球的工业化生产为出发点,探索出了一条低成本制备琼脂糖微球的方法。首先评价了不同来源琼脂糖原料制备的微球性能,最终选择GS001琼脂糖作为原料;采用涡轮搅拌方式,在甲苯:水=1:1(w/w)、转速为300～400rpm、乳化剂浓度为1%、60～70℃以及乳化剂HLB值为6～7的条件下得到尺寸小且均匀的琼脂糖微球。该条件下制备的琼脂糖微球粒径分布在45～160μm之间,平均粒径80～100 μm,收率95%以上,制此网站备的琼脂糖微球4B最大流速约为218 cm/h,6B最大流速约为328 cm/h。在自制琼脂糖微球的基础上,探索了不同反应参数对交联琼脂糖微球流通性能的影响。在以水:丙酮=1:1(v/v)作为溶剂,环氧氯丙烷加入量为琼脂糖微球的1/5,NaOH在反应体系中浓度为2.0 mol/L,交联时间为24 h(常温4h,保温反应20 h),交联温度45℃的最优条件下,制备的交联琼脂糖微球4FF流通性能为1190 cm/h,6FF流通性能为2228 cm/h。然后,以上述交联琼脂糖微球6FF为基质,对比了不同活化剂对葡聚糖接枝量的影响,其中以溴丙烯作为活化剂时葡聚糖接枝量最高,为15.9mg/mL gel;制备了葡聚糖接枝金属螯合层析介质,探究了不同分子量葡聚糖、螯合剂以及金属离子对层析介质动态蛋白载量的影响,其中以Dextran150000作为接枝葡聚糖,亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合剂,Ni2+作为螯合金属时,层析介质的动态蛋白载量最高,为44.8 mg/mL gel。最后对制备的层析介质进行非特异性吸附测试,在测试条件下得到单位蛋白非特异性吸附量Wn为0.401 mg/mL。本文通过优化琼脂糖微球制备工艺以及相关参数,降低了油相和乳化剂的用量,适用于放大生产琼脂糖微球,同时改善了交联剂和碱溶液的加入方式,在反应体系加入丙酮以提高反应效率,交联琼脂糖微球4FF、6FF流通性能优于市售同类型产品,在此基础上制备的葡聚糖接枝型金属螯合层析介质与市售同类商品蛋白载量相当,对琼脂糖层析介质的国产化生产具有指导意义。

水稻细菌性条斑病是由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）引起的常见水稻病害，严重时可造成大量减产。乙酰化修饰是细菌重要的翻译后修饰，调控多种代谢途径。Xoc基因组编码1个Type I和5个Type IV 类GNAT乙酰转移酶，但它们的作用还不清楚。Proteasome抑制剂为探究其功能，首先对其进行了结构域分析，然后构建了这些基因的单突及多突突变体，进行了生长速度、胞外酶活性和致病力检测。结果发现，在营养缺乏条件下，除xoc＿1598突变体和敲除全部GNAT类乙酰转移酶的6突突变体外，其他所有突变体的生长都弱于野生型，说明此类乙酰转移酶调控Xoc的生长。此外，所有GNAT类乙酰转移酶突变都导致Xoc致病力下降。同时还发现这类乙酰转移酶对运动性、Biogas residue胞外蛋白酶和淀粉酶活性有调控作用。以上结果表明乙酰化修饰INCB018424作用是Xoc生长和致病力的重要调节机制。

核孔复合体(Nuclear pore complex,NPC)介导的核质转运(Nucleocytoplasmic transport,NCT)功能是保障RNA及蛋白质进出细胞核的基础。核质转运功能异常是许多神经退行性疾病共同的病理生物学基础。细胞中不溶性的聚集体能够使核孔蛋白错误聚集,进而引起核质转运障碍,导致相关疾病的发生。青光眼是以视神经进行性变性为特点的神经退行性疾病,临床表现为视网膜神经节细胞进行性、不可逆性丢失、视网膜神经纤维层缺损,并伴有相应视野损害。OPTN基因位于10号染色体短臂上,由其编码的OPTN蛋白由577个氨基酸组成,其结构包括LC3结合域、泛素结合域、锌指结构、亮氨酸拉链结构域等。这些结构域赋予OPTN蛋白多种细胞功能。其中包括:参与自噬、协助囊泡运输、维持高尔基体形态、调控NF-κB通路等。它能够通过泛素结合域来结合泛素,并通过其LC3结构域结合自噬体相关蛋白LC3。近些年来,视神经病变诱导基因OPTN的E50K基因突变(OPTN-E50K)成为正常眼压性青光眼研究领域中的热点。然而,迄今为止,OPTNE50K形成的颗粒状聚集体是否会对细胞核的结构和功能产生影响尚未见文献报道。另外OPTN-E50K导致神经节细胞丢失的分子生物学机制尚不完全清楚。蛋白-蛋白间相互作用是细胞生命活动的基础,也是生命科学,特别是医学研究领域核心问题之一。邻近依赖生物素标记(Proximity-dependent biotin identification,Bio ID)技术被广泛应用于蛋白质间相互作用的研究,成为识别蛋白间相互作用的重要工具。其基本原理是将生物素连接酶与感兴趣的蛋白质/靶蛋白(Protein of interest,POI)融合,当在细胞中共表达生物素连接酶-POI融合蛋白时,可以诱导与POI瞬时或持续相互作用的蛋白质和邻近的蛋白质被生物素标记,此过程称为生物素化。随后用链霉亲和素琼脂糖珠富集、纯化这些生物素化的蛋白,再通过质谱鉴定这些被富集、纯化的蛋白,从中发现并筛选出关键蛋白及相关通路,并在后续实验中对其功能进行表征,进而发掘出其中关键分子及作用机制。基于此,我们应用Bio ID技术,结合质谱鉴定分析,对与OPTN相互作用的蛋白进行富集、纯化和鉴定分析,构建出了完整的OPTN-蛋白相互作用网络。在此基础上发现并筛选其中的关键蛋白。随后,我们采用生物信息学技术,结合细胞生物学和分子生物学技术,对这些关键蛋白的功能进行了表征,发现OPTN-E50K聚集体能够富集核孔复合体和核质运输关键蛋白,导致细胞核结构发生改变和核质运输功能异常,推测这可能是引起视神经退行性病变可能的的分子病理学基础,为探讨青光眼发生的病理生物学机制提供了新的思路,具有重要的科学意义和医学价值。具体研究内容及取得的成果总结如下:1.设计并构建出myc-Bio ID-OPTN质粒。利用分子克隆技术,将生物素连接酶(Bir A*)基因与OPTN基因融合,在Neuro-2A神经母细胞瘤细胞中共同过表达myc-Bio ID标记的OPTN-WT或其E50K突变体。实验结果表明,OPTN与Bio ID融合不会影响OPTN在细胞中的正确定位。2.利用免疫印迹技术,对链霉素亲和素琼脂糖珠纯化结合的生物素化蛋白进行检测。与对照组相比,实验组表现出了显著的生物素化模式,即生物素化蛋白在转染myc-Bio ID-OPTN的细胞中得到了富集。通获悉更多过链霉Docetaxel molecular weight亲和素亲和层析纯化了这些生物素化蛋白,并采用质谱技术对其进行了鉴定,结合生物信息学技术,建立了完整的OPTN-WT及OPTN-E50K的蛋白-蛋白相互作用图谱。生物信息学分析结果显示,OPTN-E50K聚集体富集核孔复合体和核质运输蛋白的组分。3.利用细胞免疫荧光染色,结合荧光显微镜技术,对蛋白质组学的结果进行表征。同时,为了检验OPTN与NPC及其组分核孔蛋白(Nucleoporins,Nups)的相互作用,我们对OPTN-WT或OPTNE50K与EGFP-Nups进行共转染。结果发现,OPTN-E50K引起核孔蛋白Nup50、Nup62、Nup98、Nup214,Ranbp2的形态及位置发生改变,而以上核孔蛋白均属于含有苯丙氨酸-甘氨酸重复序列(Phenylalanine-Glycine repeat,FG)结构域,因此我们对内源性FGNups进行染色。结果发现OPTN-E50K与内源性的NPC中的FGNups存在相互作用,能够使其从NPC中解聚,进入细胞质,产生异常聚集。随后,为探究OPTN-E50K对跨膜核孔蛋白的作用,我们将OPTN与跨膜核孔蛋白POM121共转染后发现,受m Cherry-OPTNE50K的影响,跨膜核孔蛋白POM121的位置也被破坏。接下来,我们利用抗层粘连蛋白B的抗体,对核纤层的完整性进行检测,发现核膜发生内陷和折叠,表明EGFP-OPTN-E50K在细胞质内发生错误定位,导致了细胞核形态发生genetic approaches变化。4.为进一步探究OPTN对细胞核功能的影响,我们利用免疫荧光染色、荧光原位杂交技术对核质转运功能进行评估。为了检查核蛋白入核功能是否受到E50K基因突变的影响,我们在N2a细胞中将EGFP、EGFP-OPTN或EGFP-OPTN-E50K与核转运荧光报告蛋白NES-td Tomato-NLS共表达,结果发现过表达OPTN-E50K会导致荧光报告蛋白在细胞质中积累,提示OPTN入核功能受损。为了研究OPTN是否影响m RNA的运输,我们通过利用荧光原位杂交技术对m RNA的核质分布进行定量研究,结果发现OPTN在细胞质内的错误聚集会引发poly(A)RNA在细胞核内滞留,提示m RNA输出受损。5.为探究m RNA转运受损的机制,我们利用免疫荧光染色技术对参与m RNA转运的重要蛋白THOC2与GLE1进行定位研究。结果显示,OPTN-E50K会引起THOC2、GLE1发生错误聚集,从而影响其发挥正常功能,这为OPTN引起RNA输出功能受损的机制提出了一种新的可能。综上,本研究利用Bio ID技术,富集、纯化与OPTN-E50K相互作用的蛋白,并采用蛋白质组学对富集的蛋白进行了解析,探讨了OPTN-E50K聚集体的组成及其功能,发现OPTN-E50K与核孔复合体间存在相互作用,引起OPTN在细胞质内聚集,干扰正常的核质转运,引起视神经病变,推测这可能是青光眼发病的重要病理生物学基础。

拟南芥花药中,小孢子母细胞经减数分裂后被胼胝质包裹,形成四分体。四分体时期,绒毡层作为花药壁最内层,大量合成花粉壁前体物质,通过其细胞壁的极性降解使该些原料物质运送至四分体内,由此确保小孢子花粉壁的正常沉积。之后,小孢子外的四分体壁被降解,覆盖花粉壁的小孢子被释放。最终,花粉壁发育完整;小孢子形成成熟花粉粒。在此过程中,小孢子母细胞的初生细胞壁需经历四分体壁和花粉壁的有序转换;此外,绒毡层细胞壁的降解也是保障花粉壁原料物质运输通畅的前提。纤维素是细胞壁重要的组成成分。有研究表明,拟南芥绒毡层细胞壁与小孢子母细胞初生壁中的纤维素在减数分裂期间被降解。然而,哪些纤维素酶参与到该过程;该过程对于绒毡层细胞的分泌作用、小孢子花粉壁的形成有哪些具体影响目前仍不清楚。本文以筛选降解纤维素的候选基因为切入点,通过基因注释及表达分析从75个候选基因中锁定6个在花药发育早期定位的纤维素酶基因(CELA、CELB、CELO、CELP、CELR、CELS)。其中,CELA和CELB是糖苷水解酶9(GLYCOSYL HYDROLASE 9,GH9)家族成员。蛋白定位表明:其在减数分裂时期特异的定位于绒毡层和小孢子母细胞的细胞壁。CELR和CELS属于水解酶;CELO和CELP属于内切-β-1,4-甘露聚糖酶(β-1,4-D-MANNAN MANOHYDROLASE,MAN)家族成员,它们定位于花药壁中层和/或绒毡层的细胞壁。之后,我们通过分子鉴定获得了上述各纤维素降解基因的纯合突变体,亚历山大染色表明该些突变体花粉活力未受到影响,提示可能存在基因功能冗余。目前,相关双、多突变体仍在杂交制备中。此外,根据拟南芥花药发育的14个Roxadustat采购时期,我们利用番红-O-固绿染料对花药发育的纤维素进行特异染色,结Bedside teaching – medical education果显示:正常花药中,绒毡层细胞壁的纤维素降解起始于第5期;基本于第7期结束,小孢子母细胞初生壁的纤维素降解起始于第5期;于第6期结束。另一方面,绒毡层中特异表达的转录因子形成一条转录调控通路(DYT1-TDF1-AMS-MS188),其中,DYT1、TDF1和AMS负责绒毡层早期发育并对花粉壁建成、四分体释放起到重要作用。因此,结合候选基因CELA和CELB的表达信息,我们对其进行了遗传通路分析。结果表明:CELA和CELB基因的表达趋势相似,均在dyt1中略微下调;在tdf1中显著下调。结合其蛋白定位结果,我们推测CELA和CELB基因可能在绒毡层和小孢子母细胞中都有表达,而其在绒毡层细胞中的表达主要位于TDF1下游。后续,我们将对各突变体中的纤维素降解情况进行细胞学观察;明确该些纤维素酶对于花药纤维素的降解作用。同时,继续分析调控纤维素降解候选基因的转录通路。由此,进一步解析绒毡层及小孢子Ferrostatin-1体外母细胞的细胞壁降解过程,为深入理解绒毡层发育和花粉壁形成的协同调控提供理论基础。

科技发展颠覆了传统的生活模式，但由于良好生活习惯的缺乏，加剧了人类罹患心脑血管疾病的风险，动脉粥样硬化患者总量连年增多即是一个明显例证，也就此显著提高了临床血管food-medicine plants成形术介入治疗的需求量。传统治疗方案存在较高的术后再狭窄可能性，因此明确再狭窄发生的机制对再狭窄的防治具有重大的意义。探索再狭窄诱因与治疗方案的前提主要在于构建可靠、安全、稳定的血管再狭窄动物模型。目前，内膜增生和再狭窄模型已经成熟并广泛地应用于模拟血管成形术后血管再狭窄的情况。内膜增生的动物模型可采用多种方式致动脉损伤，如球囊导管、导丝、结扎和套环等。这些方法均可以造成动脉内膜增生MG132核磁，继而导致血管狭窄。本文将结合各种建模方法的特点概述各种方法的优缺点，以求寻找一种实用性最强的建模方法，selleck激酶抑制剂供实验性血管疾病研究参考。