PDK1信号通路

该研究旨在探讨白头翁汤正丁醇提取物(n-butanol extract of Pulsatilla Decoction， BEPD)通过激活BMP信号通路发挥对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC)的治疗作用。C57BL/6小鼠分为6组：对照组、UC模型组、美沙拉嗪组及BEPD低、中、高剂量组。除对照组外，其余各组小鼠连续7 d自由饮用3%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium， DSS)建立UC模型，然后进行不同浓度的BEPD和美沙拉嗪灌胃治疗。记录各组小鼠体质量和疾病活动指数(disease activity index， DAI)。处selleck NMR死小鼠后，取结肠组织进行组织学分析， 采用阿利新蓝/过碘酸雪夫染色法(AB/PAS)检测杯状细胞的数量及黏液分泌状况，免疫组化法检测结肠组织中增殖标志物(ki67)、活化半胱天冬酶3(cleaved caspase-3)、粘蛋白2(mucin2，Muc2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达，免疫荧光法检测结肠组织中紧密连接蛋白的表达，酶联免疫吸附法(Eneurodegeneration biomarkersLISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素（interleukin， IL）-1β和IL-6的水平，Western blot(WB)检测小鼠结肠组织中与BMP通路相关蛋白的表达，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测小鼠结肠杯状细胞分化相关基因表达。在体外细胞学实验中，进一步验证BEPD含药血清对脂多糖(LPS)诱导下的LS174T杯状细胞屏障功能的保护作用及其机制。结果表明，BEPD显著缓解UC小鼠的一般症状，恢复杯状细胞分化功PS-341细胞培养能，促进Muc2分泌和紧密连接蛋白的表达，并抑制炎症因子的分泌，同时激活BMP信号通路。因此，该研究提示BEPD可能通过激活BMP信号通路发挥治疗UC的作用，为药物干预UC提供了新的思路。

生物质聚合物材料具有可生化性、可加工性、可组合性和对食品无污染等优点,已成为食品包装、伤口敷料等领域的研究热点。海藻酸钠是一种天然多糖,因其优异的水溶性、凝胶性以及生物相容性被广泛应用于制备生物降解复合膜以及水凝胶等材料。然而,作为天然聚合物材料的多糖会直接或间接为空气中大量的微生物(细菌、真菌等)提供营养来源,促进了细菌和真菌的繁殖和生长,对天然聚合材料的性能与使用寿命有着不可逆损害。本文以海藻酸钠为基体,设计并制备了两种复合型抗菌材料,对延长食品的货架期、保障食品安全和减少食源性疾病的发生具有重要的意义。具体研究内容如下:(1)采用响应面法优化了花生红衣中多酚的提取条件,分析了该提取物的主要化学成分,测定了最小抑菌浓度及抗菌效果。结果表明,花生红衣提取物(PSE)提取最佳工艺参数分别为超声时间40 min,超声温度60℃,料液比为1:20,乙醇浓度为80%,总酚含量为137mg/g。PSE的主要多酚活性化学成分为百里酚和儿茶素;此外,PSE对4种细菌的抑菌效果依次为:鼠伤寒沙门氏菌(MIC,1.4 mg/m L)>金黄色葡萄球菌(MIC,1.4 mg/m L)>大肠杆菌(MIC,2.8 mg/m L)>单增李氏特菌(MIC,2.8 mg/m L)。(2)采用纳米纤维素(CNFs)及海藻酸钠(SA)制备了SA/CNF/Ca~(2+)复合膜及添加PSE的SA/CNFs/Ca~(2+)/PSE(SCCP)抗菌复合膜。与SA/CNFs/Ca~(2+)复合膜相比,SCCP复合膜具有较高的机械强度、良好的耐水性、以及优异的紫外阻隔性能。抗菌与抗氧化性试验表明,SCCP复合膜的ABTS自由基清除活性高于DPPH自由基清除活性,最大清除ABTS活性为99.28%。SCCP复合膜对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌率为94.48%,其次为金黄色葡萄球菌(93.38%)、大肠杆菌(79.88%)和单增李氏特菌(71.50%)。水果保鲜试验表明,浸渍于SCCP膜溶液的水果腐烂率和失重率低于对照组。(3)为了提高PSE的稳定性与生物利用度,采用羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)对PSE进行包埋制备了包合物(IC),进一步以IC作为还更多原剂和稳定剂制备了粒径小,分散均匀的包合物-纳米银(IC-Ag NPs)复合纳米材料。结果表明:IC的包封率为87.26%,与PSE相比,IC在三种湿度环境中储存率均高于PSE;缓释试验结果表明IC在p H值为7.2时,可快速释放出PSE中的活性多酚物质。通过响应面优化分析可得,IC-Ag NPs制备最佳工艺参数分别为IC浓度为10.4 mg/m L,Ag NO_3浓度为0.6 m M,反应温度为90℃;优化的IC-Ag NPs粒径分布均匀,平均大小为16Cathodic photoelectrochemical biosensor.17 nm,对银离子的还原率为88.47%。IC-Ag NPs对4-硝基酚快速的催化还原性能,5min催化降解效率为97.99%。与PSE、HP-β-CD相比,绿色合成的IC-Ag NPs对于革兰氏阴(阳)性细菌具有优异的抗菌性能,对于金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为4.5μg/m L、9μg/m L;最小杀菌浓度均为72μg/m L。(4)为了拓展IC-Ag NPselleckchem GSK2118436s的应用范围,构建了用于IC-Ag NPs可控输送的海藻酸钠/葡萄糖酸-δ-内酯/Ca~(2+)(SGCA)水凝胶,并通过FT-IR、DSC、XPS、SEM、XRD表征了水凝胶的结合机理,研究了不同p H条件下的Ag NPs在水凝胶中释放/膨胀行为。结果表明,当IC-Ag NPs的浓度大于0.8 mg/m L时,水凝胶的机械强度随着IC-Ag NPs的添加量增加而降低。添加IC-Ag NPs的水凝胶在p H值为6.8的磷酸缓冲溶液中IC-Ag NPs的累积释放量最大为98.21%,该释放控制存在扩散的释放机制。SGCA水凝胶的流变性能表明,当添加的IC-Ag NPs浓度大于0.4 mg/m L时,水凝胶的G′与G″值随IC-Ag NPs的含量增加而逐渐下降。抗氧化结果表明,SGCA水凝胶在p H为6.8的环境中对ABTS自由基清除率最大为93.82%。抑菌结果表明,载有IC-Ag NPs的水凝胶对革兰氏阴性细菌的作用明显大于对革兰氏阳性细菌的作用,这与细菌细胞壁组成和结构的差异有关。

目的 探究柠檬苦素对溃疡性结肠炎（UC）大鼠肠道损伤和肠道菌群紊乱的改善作用及机制。方法 构建UC大鼠模型，将建模成功的70只大鼠随机分为模型组和柠檬苦素低、中、高剂量组（12.5、25、50 mg/kg）以及柳氮磺胺吡啶组（阳性对照组，500mg/kg），每组14只；另取14只大鼠作为对照组。各组大鼠灌胃相应药液或等量生理盐水，每天1次，连续2周。末次给药结束24 h后，观察大鼠一般情况并称重，取结肠组织进行结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分；检测大鼠结肠组织中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平；观察大鼠结肠组织病理学变化；检测大鼠结肠组织中紧密连接蛋白1(Claudin-1)、闭合蛋白（Occludin）、闭锁小带蛋白1(ZO-1)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、晚期糖基化终末产物受体（RAGE）蛋白的表达水平；基于16S rRNA检测大鼠肠道菌群的相对丰度。结果 与对照组相比，模型组大鼠精神状态不佳、皮毛较暗、情绪烦躁易发怒，结肠组织腺体排列杂乱，出现炎症细胞浸润和细胞坏死、水肿现象；CMDI评分和结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，HMGB1、RAGE蛋白表达水平以及肠道变形菌门、拟杆菌门菌群的相对丰度均显著升高（P<0.05）；体重和结肠组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达水平以及肠道厚壁菌门菌群的相对丰selleck度均显著降低（P<0.05）。与模型组相比，柠檬苦素各剂量组大鼠一般情况和结肠组织病理损伤均改善，NSC 119875上述指标水平均显著逆转（P<0.05），且具有剂量依赖性（P<0.05）；柳氮磺胺吡啶组与柠檬苦素高剂量组大鼠各项指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 柠檬苦anti-folate antibiotics素可改善UC模型大鼠肠道损伤及肠道菌群紊乱，其作用机制可能与下调HMGB1/RAGE信号通路活性有关。

目的：观察蛇床子素对人肝内胆管癌HuCCT1细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法：采用细胞增殖与活性检测-8(CCK-8)法检测10、20、40、80、120μmol·L~(-1)蛇床子素对HuCCT1细胞增殖的影响；分别设置空白组、蛇床子素低、中、高浓度组（16、32、64μmol·L~(-1)）；采用平板克隆实验检测Y-27632分子量蛇床子素对细胞克隆形成率的影响；采用流式细胞术检测蛇床子素对细胞周期与凋亡的影响；采用Hoechst33342荧光染色实验检测蛇床子素对细胞凋亡形态的影响；采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛇床子素对细胞周期蛋白B1(cyclin B1)、增殖细胞核抗原（PCNA）、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、剪切的Caspase-9(cleaved Caspase-9)、剪切的Caspase-3(cleaved Caspase-3)、剪切的多聚（ADP-核糖）聚合酶PARP(cleaved PARP)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、磷酸化核糖体蛋白（p-RPS6）表达水平的影响。结果：与空白组比较，蛇床子素组（40、80、120μmol·L~(-1)）细胞存活率明显降低（P<0Translational Research.05,P<0.01），其半数抑制浓度（IC_(50)）为63.8μmol·L~(-1)；与空白组比较，蛇床子素组（32、64μmol·L~(-1)）细胞的克隆形成率显著降低（P<0.01），蛇床子素组（32、64μmol·L~(-1)）细胞G2期细胞数量增加（P<0.05,P<0.01），蛇床子素组（32、64μmol·L~(-1)）细胞数量明显减少，核固缩、碎裂增多，细胞凋亡率增加（P<0.05,P<0.01），蛇床子素组（32、64μmol·L~(-1)）细胞中cyclin B1、PCNA、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、p-Akt、p-mTOR、C59p-RPS6表达降低（P<0.05,P<0.01）,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、cleaved PARP表达升高（P<0.05,P<0.01）。结论：蛇床子素可抑制HuCCT1细胞增殖，促进其凋亡，其机制可能与Akt/mTOR信号通路有关。

目的：运用网络药理学和分子对接的方法，探索健脾疏肝方治疗非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的潜在机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology,TCMSP）和已发表的文献筛选健脾疏肝方的活性化合物和潜在作用靶点，利用人类基因数据库（GeneCards）、在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man,OMIM）和药物靶标数据库（therapeutic target database,TTD）筛选NAFLD的相关靶点，预测健脾疏肝方治疗NAFLD的潜在靶点。利用STRING数据库和Cytoscape软件构建共同靶标的PPI网络。利用DAVID数据库及微生信云平台进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。最后利用AutoDock Vina和Pymol软件对核心靶点和主要活性化合物进行分子对接。结果：共筛选出117个活性化合物和279个潜在靶标，其中槲皮素（Quercetin）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（Stigmasterol）、山柰酚（kaempferol）为健脾疏肝方主要活性化合物。PPI网络显示白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、信号转换器和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,Erdafitinib采购STAT3)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2Embryo biopsy,PTGS2)和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth fBafilomycin A1配制actor,VEGFA)是关键靶蛋白。KEGG通路富集分析结果显示，癌症、TNF、乙型病毒性肝炎、MAPK、PI3K-Akt及NAFLD信号通路可能是健脾疏肝方干预NAFLD的潜在机制。分子对接结果表明，健脾疏肝方主要活性化合物与核心靶标具有良好的结合能力。结论：健脾疏肝方可以通过多组分、多靶点及多通路起到干预NAFLD的作用。

目的Preformed Metal Crown:免疫抑制肿瘤微环境为胆管癌转移创造有利条件,与预后不良密切相关。本文基于前期基础,探究a PKC-ι诱导胆管癌CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞变化及免疫抑制的相关机制。方法:利用单细胞测序数据分析胆管癌组织中CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞的分布(包括细胞亚群和组织分布)及功能,并通过多重免疫组化染色和流式实验验证上述分析结果。利用CFSE稀释实验检测a PKC-ι过表达胆管癌细胞诱导的CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞的免疫抑制功能。通过体外实验检测a PKC-ι对胆管癌细胞HIF-1α/TGF-β1信号通路的调控作用。利用流式检测HIF-1α/TGF-β1在a PKC-ι诱导的胆管癌CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞数目变化及免疫抑制中的作用。收集临床标本,验证a PKC-ι、HIF-1α与TGF-β1之间表达关联及其与胆管癌患者预后的相关性。利用IP实验、蛋白降解实验和泛素化实验探究a PKC-ι影响HIF-1α表达的具体调控机制,并通过体内外实验验证该机制对a PKC-ι/HIF-1α/TGF-β1信号轴的调控作用,及其对共培养体系中CD4~+CD25~-FOXP3~+T细Entinostat临床试验胞数目与免疫抑制因子表达变化的影响。结果:胆管癌组织CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞数目增多,且高表达CTLA4、BATF和TNFRSF4/9/18等基因,与调节性T细胞的分布及功能相似。a PKC-ι过表达胆管癌细胞诱导的CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞具有免疫抑制功能。在胆管癌细胞内a PKC-ι与HIF-1α结合,经去泛素化途径诱导HIF-1α蛋白累积入核并促进HIF-1下游靶基因TGF-β1表达,进而诱导胆管癌CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞增多,促进肿瘤免疫抑制。结论:(1)胆管癌组织中CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞比例较癌旁组织显著增加,且免疫抑制相关基因表达上调。(2)a PKC-ι过表达胆管癌细胞诱导的CD4~+CD25~-FOXRSL3P3~+T细胞具有免疫抑制功能。(3)a PKC-ι经去泛素化途径调控HIF-1α/TGF-β1信号通路,诱导CD4~+CD25~-FOXP3~+T细胞增多,促进胆管癌免疫抑制。(4)a PKC-ι、HIF-1α、TGF-β1在胆管癌组织中表达上调并呈正相关,与预后不良密切相关。

研究背景动脉粥样硬化是导致冠心病、心力衰竭等心血管疾病的主要原因。目前认为脂质代谢异常诱导的血管内皮损伤是导致动脉粥样硬化形成的关键因素,在动脉粥样硬化形成过程中血管内皮是最先受到损伤的部位。由此,靶向保护血管内皮细胞进而减轻动脉粥样硬化机制的相关研究引起了人们的关注。近年来研究发现,成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、FGF5等生长因子通过抑制细胞凋亡和炎症等途径来减轻内皮细胞损伤,生长因子被认为是调节内皮细胞稳态的主要因子。表明生长因子可能为进一步阐明动脉粥样硬化的发生发展机制提供了新思路。FGF21被认为是一种与细胞损伤相关的生长因子,目前已证实寒冷、禁食/饥饿和某些病理条件刺激后可以引起其水平升高,然而FGF21水平升高的作用及其机制等仍存在争论。有研究发现,冠心病患者血清中FGF21水平升高与未来发生心血管不良事件风险存在着关联性;过表达FGF21促进肌肉萎缩、骨质流失。与此相反,有实验发现,外源性FGF21可以通过抑制内皮细胞焦亡从而减轻内皮损伤;还有研究证实外源性FGF21通过促进脂联素分泌、抑制胆固醇合成和促进胆固醇排出改善脂质代谢紊乱,也可以通过增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平、降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平抑制氧化应激,进而延缓动脉粥样硬化的进展。但是,FGF21与血管内皮细胞损伤的关系尚不十分清楚。因此,需要进一步探讨FGF21对脂质代谢异常诱导的内皮细胞损伤介导的动脉粥样硬化的影响。铁死亡是一种铁依赖的、脂质过氧化驱动的死亡方式,其发生是细胞内脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)生点击此处成与降解的平衡失调所致。动脉粥样硬化主要特征是脂质代谢紊乱,血液中增多的低密度脂蛋白胆固醇进入血管内皮下,被氧化修饰后生成氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxidized low density lipoprotein cholesterol,ox LDL-C),进而加重内皮细胞损伤,提示铁死亡可能参与动脉粥样硬化形成过程中血管内皮细胞损伤。最近也有研究发现,抑制铁死亡可以减轻脂质代谢异常引起的内皮细胞损伤。此外,在铁死亡发生过程中,Fe~(2+)和H_2O_2反应会生成具有强氧化能力的羟自由基和Fe~(3+),Fe~(3+)又被过氧化物(O~(2-))进一步还原成Fe~(2+),重新与H_2O_2反应,这个循环中会大量生成羟基自由基,是产生ROS较强的反应之一。在糖尿病心肌病中发现,铁死亡抑制剂较凋亡抑制剂、坏死抑制剂能够更好地减轻心肌损伤,表明铁死亡在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中的作用可能更为关键。还有研究发现,过表达FGF21或重组FGF21蛋白能够抑制铁死亡减轻肝细胞损伤和纤维化。研究FGF21对血管内皮细胞铁死亡的影响能够进一步阐释FGF21对血管内皮细胞损伤导致的动脉粥样硬化的作用机制。研究认为FGF21与其受体FGFR1结合后激活肝激酶B1,促使AMPKα亚基的172位点磷酸化。已有研究证实AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)激活后通过提高谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达,进而抑制脂质代谢紊乱引起的巨噬细胞铁死亡。此外,AMPK还可以激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2),促进其核易位。NRF2是转录激活因子,在抗氧化反应中发挥重要的作用。NRF2的激活可以提高GPX4和铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)的表达,通过抑制脂质过氧化物的产生和蓄积,进而减轻心肌损伤。已有研究证实AMPK/NRF2途径调控的相关蛋白被认为是铁死亡的关键分子。这些发现表明FGF21可能通过AMPK/NRF2信号通路抑制脂质代谢异常诱导的血管内皮细胞铁死亡。本研究以FGF21为切入点,结合体内和体外实验,探讨FGF21是否通过AMPK/NRF2信号通路抑制脂质代谢异常诱导的内皮细胞铁死亡,为FGF21在动脉粥样硬化形成中的治疗应用提供了理论依据。研究方法1.分析FGF21在内皮细胞损伤和动脉粥样硬化形成中的表达变化。(1)收集冠心病患者血清,应用Elisa试剂盒检测FGF21在冠心病患者血清中的含量。(2)高脂饲料喂养Apo E~(-/-)小鼠12周构建动脉粥样硬化模型,利用western blot和Elisa试剂盒分别检测高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠动脉粥样硬化组织及血清中FGF21的含量。(3)应用150μg/m L的ox-LDL处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)24小时构建内皮细胞损伤模型,利用western blot检测ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中FGF21的表达变化。2.明确FGF21对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤和高脂饮食诱导的动脉粥样硬化的影响。(1)使用ox-LDL处理慢病毒转染后的高低表达FGF21内皮细胞,利用CCK-8试剂盒检测细胞活力,LDH试剂盒检测LDH释放量以及基质胶小管实验检测内皮细胞血管生成能力,明确FGF21对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的影响。(2)探究FGF21减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤是在细胞内还是通过分泌到细胞外来发挥其保护作用。我们首先利用蛋白转运抑制剂莫能菌素(5μM)预处理过表达FGF21内皮细胞6 h,再联合ox-LDL共同处理24 h,通过检测细胞活力、LDH释放量和血管生成能力的变化,评估FGF21在细胞内的作用。其次,我们利用200 ng/m L的重组FGF21蛋白预处理内皮细胞6 h,再联合ox-LDL共同处理24 h,重复上述实验,评估外源性FGF21的作用。(3)高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠腹腔注射重组FGF21蛋白(0.1 mg/kg/day),利用油红O染色和HE染色检测主动脉斑块面积,生化试剂盒检测血脂变化,分析外源性FGF21能否减轻动脉粥样硬化病变。3.探讨FGF21是否通过调控铁死亡减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤和改善动脉粥样硬化。(1)在小鼠动脉粥样硬化模型中,应用铁检测试剂盒检测主动脉组织中亚铁离子水平,MDA和GSH试剂盒检测脂质过氧化水平,western EGFR抑制剂blot检测铁死亡相关蛋白ACSL4、GPX4、FTH和HO-1的表达变化,免疫荧光染色检测血管内皮细胞中GPX4的表达变化,分析高脂饮食能否引起血管内皮细胞铁死亡。(2)在内皮细胞损伤模型中,通过检测ROS、线粒体膜电位、亚铁离子、脂质过氧化水平和铁死亡相关蛋白的表达变化,探究ox-LDL是否引起内皮细胞铁死亡。(3)ox-LDL处理高低表达FGF21的内皮细胞,通过检测铁死亡相关指标的表达变化,综合评估FGF21对ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡的调控作用。(4)为了探讨FGF21是在细胞内还是通过分泌到细胞外来调控铁死亡,我们首先利用蛋白转运抑制剂莫能菌素预处理过表达FGF21内皮细胞,通过检测铁死亡相关指标的表达变化,分析FGF21在细胞内能否抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。其次,重组FGF21蛋白预处理内皮细胞,重复上述实验,探究外源性FGF21是否调控ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。(5)高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠腹腔注射重组FGF21蛋白,通过检测铁死亡相关指标的表达变化,探究外源性FGF21对小鼠血管内皮细胞铁死亡的影响。4.基于AMPK/NRF2信号通路阐明FGF21调控ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡的机制。(1)Western blot检测ox-LDL处理的内皮细胞和小鼠动脉粥样硬化组织中AMPK/NRF2的表达变化。(2)Western blot检测重组FGF21蛋白联合ox-LDL处理的内皮细胞,腹腔注射重组FGF21蛋白的小鼠主动脉组织中AMPK/NRF2的表达变化,明确外源性FGF21对AMPK/NRF2表达的影响。(3)在重组FGF21蛋白预处理的内皮细胞中,应用AMPK抑制剂(Compound C,10μM)预处理内皮细胞6 h,再联合ox-LDL共同处理24 h,通过检测细胞活力和铁死亡相关指标的表达变化,探究AMPK/NRF2信号通路在外源性FGF21抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡中的作用。研究结果1.FGF21在冠心病患者血清、小鼠动粥样硬化组织和血清、以及ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中表达升高。2.FGF21减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤并抑制高脂饮食诱导的动脉粥样硬化形成。(1)与ox-LDL处理组相比,过表达FGF21提高ox-LDL处理后的细胞活力、降低LDH释放量、提高血管生成能力,低表达FGF21对细胞活力、LDH释放量和血管生成能力的影响与前述相反,表明FGF21减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤。(2)与过表达FGF21+ox-LDL组相比,抑制过表达FGF21内皮细胞分泌蛋白后,细胞活力下降、LDH释放增多、血管生成能力下降;而与ox-LDL组相比,重组FGF21蛋白干预组细胞活力升高、LDH释放量降低、血管生成能力升高,提示FGF21主要通过分泌到细胞外来减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤。(3)油红O染色和HE染色结果显示,重组FGF21蛋白干预组小鼠主动脉斑块面积比高脂饮食组减小;血脂检测结果显示,相较于高脂饮食组,重组FGF21蛋白干预组小鼠血清中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量降低,而高密度脂蛋白胆固醇含量升高,表明外源性FGF21减小主动脉斑块面积并改善血脂异常。3.FGF21通过抑制铁死亡减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤并缓解动脉粥样硬化病变。(1)与对照组相比,高脂饮食引起小鼠主动脉组织中亚铁离子升高,脂质过氧化水平升高,铁死亡相关蛋白ACSL4和HO-1的表达升高、GPX4和FTH的表达降低,与血管内皮细胞标志蛋白CD31共染的GPX4表达降低,表明高脂饮食能够诱导血管内皮细胞铁死亡。(2)与对照组相比,ox-LDL处理内皮细胞后,细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位降低,亚铁离子水平升高,MDA水平升高,GSH水平降低,ACSL4和HO-1的表达升高、GPX4和FTH的表达降低,表明ox-LDL能够诱导内皮细胞铁死亡。(3)与ox-LDL处理组相比,过表达FGF21改善ox-LDL处理后的内皮细胞线粒体结构,降低细胞内ROS、亚铁离子和MDA水平,提高GSH水平,降低ACSL4和HO-1的表达,提高FTH和GPX4的表达;低表达FGF21对内皮细胞铁死亡的影响与前述相反,提示FGF21抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。(4)与过表达FGF21+ox-LDL相比,抑制过表达FGF21内皮细胞分泌蛋白后,内皮细胞线粒体嵴减少,细胞内ROS、亚铁离子和MDA水平升高,GSH水平降低,ACSL4和HO-1的表达升高,FTH和GPX4的表达降低,表明抑制过表达FGF21内皮细胞分泌蛋白后,FGF21对铁死亡的抑制作用明显减弱。然而,与ox-LDL处理组相比,重组FGF21蛋白干预组内皮细胞线粒体结构得到改善,细胞内ROS、亚铁离子和MDA水平降低,GSH水平升高,ACSL4和HO-1的表达降低、FTH和GPX4的表达升高,表明FGF21主要通过分泌到细胞外来抑制内皮细胞铁死亡。(5)与高脂饮食组相比,重组FGF21蛋白干预组小鼠主动脉组织中亚铁离子和MDA水平降低,GSH水平升高,ACSL4和HO-1的表达降低,FTH和GPX4的表达升高,与血管内皮细胞标志蛋白CD31共染的GPX4表达升高,表明外源性FGF21通过抑制血管内皮细胞铁死亡来改善小鼠动脉粥样硬化形成。4.重组FGF21蛋白通过激活AMPK/NRF2信号通路抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。(1)与对照组相比,内皮细胞损伤组和高脂饮食组中磷酸化AMPK的表达降低,核蛋白NRF2的表达升高。(2)与内皮细胞损伤组和高脂饮食组相比,外源性FGF21增加内皮细胞损伤和动脉粥样硬化组织中AMPK的磷酸化水平,并进一步提高核蛋白NRF2的表达。(3)与重组FGF21蛋白+ox-LDL组相比,抑制AMPK后,细胞活力下降、线粒体膜电位下降、MDA水平升高、GSH水平下降,ACSL4和HO-1的表达升高、FTH和GPX4的表达降低,以上结果表明,外源性FGF21通过激活AMPK/NRF2信号通路抑制内皮细胞铁死亡。结论1.临床患者血清中、小鼠血清和主动脉组织中以及细胞中内源性FGF21水平升高与ox-LDL诱导的内皮细胞损伤介导的动脉粥样硬化有关。2.通过检测ox-LDL处理内皮细胞后的细胞活力、LDH释放量和血管生成能力,结合高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠主动脉斑块面积和血脂变化,发现过表达FGF21能够减轻Predisposición genética a la enfermedadox-LDL诱导的内皮细胞损伤,低表达FGF21加重内皮细胞损伤;使用莫能菌素抑制蛋白分泌后,过表达FGF21减轻内皮细胞损伤的作用明显减弱;而重组FGF21蛋白能够显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞损伤,提示FGF21主要通过自分泌方式减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤以及缓解动脉粥样硬化病变。3.依据ROS、亚铁离子、MDA和GSH水平,ACSL4、GPX4、FTH及HO-1的表达等铁死亡相关指标,表明外源性FGF21抑制ox-LDL诱导的内皮细胞损伤和动脉粥样硬化形成作用可能与铁死亡有关。4.外源性FGF21激活AMPK/NRF2信号通路抑制了铁死亡是减轻脂质代谢异常诱导的内皮细胞损伤导致的动脉粥样硬化的主要机制之一。

山药(Dioscorea opposita Thunb.)的块茎含有丰富的营养物质,不仅药食两用,还可用作工业原料和饲料,是广泛分布于非洲、亚洲、大洋洲和南美洲等地的重要薯类作物之一,也是我国重要的经济类作物。山药块茎中淀粉是最重要的营养成分,淀粉含量的高低直接影响了山药块茎的品质与产量。因此进行山药块茎淀粉积累机制的研究,对于山药品质及产量的遗传改良具有重要意义。本研究以毕克齐山药和大和长芋山药为试验材料,分别测定块茎不同发育时期的形态及淀粉积累相关生理指标;并采用RNA-seq和Iso-seq结合的转录组学测序手段对两个品种7个发育阶段的块茎转录组学进行测序,通过生物信息学分析筛选淀粉积累相关的差异表达基因;基于RNA-Seq分析结果确定淀粉积累的关键时期进行Label-free蛋白质组学测序,通过生物信息学分析筛选淀粉积累相关差异表达蛋白;将转录组学和蛋白质组学进行联合分析,从中筛选淀粉积累相关差异表达蛋白(基因)。采用RT-PCR技术克隆FRK2基因的ORF,并对该基因的ORF进行生物信息学分析;构建瞬时表达载体注射烟草叶片,对FRK2进行亚细胞定位;利用q RT-PCR技术对果糖激酶FRK2基因在山药块茎不同发育时期、不同器官CH-223191分子量以及不同胁迫条件进行表达分析,并将该基因的表达量与块茎淀粉含量、蔗糖含量及淀粉积累相关酶活性进行相关性分析;构建FRK2基因的植物表达载体,并对烟草叶片进行转化,鉴定其功能。为明确山药块茎膨大期蔗糖和淀粉代谢淀粉积累机制、山药块茎品质及产量的提高提供了理论依据。研究得出以下结论:(1)高淀粉品种毕克齐山药中块茎蔗糖合酶、果糖激酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合酶以及α-淀粉酶活性均显著高于低淀medial rotating knee粉品种大和长芋山药;块茎干物质含量、蔗糖合酶、果糖激酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合酶以及α-淀粉酶活性对淀粉积累起到正向调控的作用,蔗糖含量和蔗糖磷酸合酶活性对淀粉积累起到负向调控的作用;块茎膨大盛期淀粉颗粒体积明显增大。(2)转录组学数据分析结果表明,两个品种中共筛选到10419个差异基因,其中在高淀粉品种毕克齐山药中筛选到5478个差异基因;低淀粉品种大和长芋山药中筛选到6849个差异基因;两个品种同一时期共筛选到5177个差异基因;形态差异最大的两个比较组合(B-90 vs B-180和D-90 vs D-180)中筛选到1556个共有差异基因与淀粉积累相关(包含107个转录因子基因),这些基因的功能与代谢过程、结合和细胞过程等有关;淀粉含量差异最大的比较组合(D-150 vs B-150)中有3557个差异基因与淀粉积累相关(包含160个转录因子基因),这些差异基因的功能与结合、催化活动、代谢过程等有关。(3)蛋白质组学数据分析结果显示,在两个品种中共此网站筛选4374个差异蛋白;淀粉积累关键的两个比较组合(B-120 vs B-180和D-120 vs D-180)中筛选到2944个共有差异蛋白与淀粉积累相关(包含5个转录因子),这些差异蛋白的功能类别为代谢过程、催化活动、有机物代谢过程等;淀粉含量差异最大的比较组合(D-150vs B-150)中筛选到3229个差异蛋白与淀粉积累相关且高淀粉品种中有更多的差异蛋白高表达(包含10个转录因子),这些差异蛋白功能类别为代谢过程、催化活动、单一生物体过程等。(4)联合分析结果表明,共有3149个差异蛋白(基因)在转录组学和蛋白质组学中被共同筛选到,其中有458个(14.54%)差异蛋白(基因)与淀粉积累有关。通过q RT-PCR验证结果显示,RNA-seq数据与q RT-PCR表达量吻合程度为85.19%。(5)根据转录组学与蛋白质组学联合分析,筛选得到果糖激酶基因FRK2,克隆了FRK2基因c DNA的ORF序列。该基因c DNA全长1002bp,对基因编码蛋白进行分析,该基因编码333个氨基酸,其编码蛋白的理论分子质量为35.83k D,等电点为5.27,无跨膜结构,属于疏水性蛋白;该基因与报道的9种植物的FRK2氨基酸序列相似性均达到82%以上,在进化上其与黄姜的亲缘关系较近。亚细胞定位的结果表明该蛋白定位于细胞质和细胞膜。(6)对FRK2基因的表达模式进行分析,FRK2基因的表达量与淀粉含量显著正相关,与蔗糖含量和蔗糖磷酸酶活性极显著负相关,与蔗糖合酶活性、果糖激酶活性、AGPase活性、淀粉合酶活性和ɑ-淀粉酶活性均极显著正相关;两个品种中FRK2基因在块茎中的基因表达量显著高于叶片和茎;FRK2基因在低温胁迫和干旱胁迫下被诱导显著高表达。(7)将FRK2基因转入烟草中进行功能分析,转FRK2基因烟草淀粉含量、果糖激酶活性以及淀粉合成酶活性均极显著高于野生型烟草,转基因烟草ɑ-淀粉酶活性显著高于野生型烟草,转基因烟草果糖含量显著低于野生型烟草;对转FRK2基因烟草和野生型烟草植株进行低温胁迫,转基因烟草淀粉含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性及过氧化氢酶活性均显著高于野生型烟草,转基因烟草MDA含量显著低于野生型烟草,转基因烟草叶片中FRK2基因被显著诱导高表达;对转FRK2基因烟草和野生型烟草植株进行干旱胁迫,转基因烟草淀粉含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性及过氧化氢酶活性均显著高于野生型烟草,转基因烟草MDA含量和失水率均显著低于野生型烟草,转基因烟草叶片中FRK2基因被显著诱导高表达。过表达FRK2基因提高了转基因烟草的淀粉含量;该基因可以被低温和干旱诱导,提高转基因烟草的淀粉含量。

该文探讨运动损伤后恢复的2个阶段，即炎症、静止、萎缩阶段和受伤肢体的康复和活动增加阶段的不同任务。分析了营养素补充对运动损伤恢复中对抗炎症和总能量摄入2个重要影响因素，在此基础上，进一步阐述了营养素补充对运动损伤的重要意义，并分别从宏量营养素、微量营养素补充对运动损伤恢复的重要性分析。概括了宏量营养素脂肪ω-3多不饱和脂肪酸抗炎作用、蛋白补充对肌肉损失的逆转作用、蛋白质/碳水化合物补充对维持能量平衡oropharyngeal infection的重要性以及水的补充起到良好的水合作用；从促进愈合的证据和抑制炎症2个方面分析微量营养素对运动损伤恢复的潜在RP56976说明书益处Dorsomorphin体外，认为微量营养素作为体内酶系统的激活剂发挥作用，使生化过程发生，并就营养素锌、维生素D和钙在运动损伤恢复中的积极作用进行探讨。最后，结合实践提出营养素、植物性矿物和适量的补剂对运动损伤具有实现恢复治疗，重塑被损伤组织的积极作用。

目的观察化瘀通络灸对血管性痴呆vasculardementia，VaD)大鼠胼胝体磷脂酰肌醇３激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）／蛋白激酶Ｂ（proteinkinaseB，Akt）／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）信号通路影响，探讨化瘀通络灸促VaD大鼠髓鞘再生的作用机制。方法经Morris水迷宫筛选后，随机选取12只大鼠纳入假手术组，剩余大鼠复制VaD模型成功后，随机分为模型组、艾灸组、艾灸+LY294002组，每组12只。艾灸组予以化瘀通络灸干预，艾灸+LY294002组在化瘀通络灸干预的基础上，予以PI3K抑制剂LY294002腹腔注射；采用Longa评分法评价各组大鼠神经功能损伤程度，Morris水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力；Westernblot法检测各组大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达；LFB髓鞘染色法Cross-species infection观察各组大鼠胼胝体髓鞘的形态；透射电子显微镜观察各组大鼠髓鞘超微结构。结果与假手术组比较，模型组和艾灸+LY294002组大鼠的Longa评分显著升高（P<https://www.selleck.cn/products/canagliflozin.html0.05），逃避潜伏期显著延长（P<0.05），PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达水平显著降低（P<0.05），胼胝内髓鞘纹理不清，排列混乱，边缘呈空泡或空网状改变，髓鞘线圈样结构离散，部分膨出和崩解，有髓神经轴突数量显著减少(P<0.05)；与模型组和艾灸+LY294002组相比，艾灸组大鼠Longa评分明显下降（P<0.05），逃避潜伏期显著缩短（P<0.05），PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达水平明显提高(P<0.05)，胼胝体内髓鞘结构有所恢复，排列整齐，边缘结构较为致密，有髓神经轴突数量显著增加(P<0.01)。结论化瘀通络灸可能通过激活PI3K/Akt/mTOR通路，修复VaD大鼠损伤髓鞘并促进其重塑，恢selleck HPLC复脑白质功能。