PDK1信号通路

目的：综合分析尿糖（Glucose In Urine,GLU）联合尿微量白蛋白（Urine microalbumin,ALB）检验用于糖尿病（diabetes mellitus,DM）早期肾损伤患者的临床诊断价值。方法：本次研究的主要对象为：DM患者（共120例，病例选取时间开始于2019年10月，截止时间为2021年10月）。根据DM患者有biologic medicine无发生早期肾损伤分为两组，一组为高度疑似合并早期肾损伤者作为观察组（60例），另一组为未合并早期肾损Mirdametinib采购伤者作为对照组（60例）。结果：观察获悉更多组GLU水平、ALB水平明显比对照组更高（P <0.05）。肾功能检验显示：60例高度疑似合并早期肾损伤中有55例阳性、5例阴性。联合检验的诊断准确度和诊断灵敏度高于单一检验（P <0.05），联合检验的诊断特异度与单一检验比较无差异（P> 0.05）。结论：GLU联合ALB检验用于DM早期肾损伤患者的临床诊断价值高。

肌肽是一种新型的食品补充剂，具有多种生物活性功能，已广泛应用于保健品、功能饮料、美容等领域，但肌肽对肝损伤修复的研究与应用鲜有报道。该研究旨在研究Glutamate biosensor肌肽对肝损伤的修复作用并探究其作用机制。肌肽预处理正常人肝细胞（normal human hepatocyte， L-02）12 h，400 mmol/mL叔丁基过氧化氢（tert butyl hydrogen peroxide， TBHP）处理L-02细胞4 h，细胞计数试剂盒NSC 119875配制-8检测细胞存活率，试剂盒检测谷丙转氨酶（alanine transaminase， ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase， AST）、活性氧（reactive oxygen species， ROS）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）水平，流氏细胞术检测细胞凋亡PUN30119，蛋白印迹定量分析氧化信号通路与凋亡信号通路的相关蛋白表达。结果表明，肌肽预处理显著降低了L-02细胞外液ALT、AST活性，抑制ROS形成，提高细胞内GSH含量，显著抑制L-02细胞凋亡，上调核红细胞2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor-2， Nrf2）、醌氧化还原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1， HO-1）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2， Bcl-2）的蛋白表达，下调Kelch样ECH关联蛋白1（Kelch like ECH associated protein 1， Keap1）、磷酸化氨基末端激酶（amino-terminal kinases phosphorylation， p-JNK）、胱天蛋白酶3（Caspase-3，Cas-3）的蛋白表达。肌肽通过调控Keap1-Nrf2与JNK-Cas-3信号通路有效修复TBHP诱导的肝细胞损伤。

目的：探讨褪黑素（MEL）对慢性束缚应激（CRS）诱导的小鼠抑郁样行为的影响及其机制。方法：将48只SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分成对照组（n=12）和CRS组（n=36），再将CRS组分为CRS+vehicle、CRSMCC950+氟西汀（FLX）和CRS+MEL三个亚组（n=12）。CRS组小鼠经14 d的CRS建模后明确抑郁样行为的变化，随后给予14 d的药物干预和CRS后再次检测行为学变化。取脑组织进行尼氏染色、RT-qPCR、Western blot及免疫荧光染色。结果：与对照组相比，CRS组小鼠体重增长显著下降，强迫游泳实验和悬尾实验不动时间显著增加，糖水消耗量显著减少，旷场实验中央停留时间和中央运动距离均显著缩短（P<0.01）。与CRS+vehicle组相比，CRS+FLX组和CRS+MEL组CRS诱导的小鼠抑郁样行为被显著逆转，额叶皮层和海马中脑源性神经营养因子（BDNF）、细胞外信号调节激酶（ERK）和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的mRNA水平，以及BDNF、磷酸化ERK1/2和CREB蛋白水平均显著升高（P<0.01）。尼氏染色结果显示，CRS+vehicle组小鼠神经元排列不Iranian Traditional Medicine规则，尼氏小体数量减少（P<0.01），而CRS+FLX组和CRS+MEL组小鼠神经元状态显著改善（P<0.01）。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，CRS+vehicle组小鼠额叶皮层和海马CA1区的c-Fos阳性细胞数量均显著增加（P<0.01）；与CRS+vehicle组相比，CRS+FLX组和CRS+MEL组小鼠额叶皮层和海马CA1区的c-Fos阳性细胞数量均显著减少（P<0.01）。结论：MEL能够显著缓解Epigenetics抑制剂CRS诱导的小鼠抑郁样行为，其机制可能与激活BDNF-ERK-CREB信号通路有关。

目的:通过建立幽门螺杆菌相关性胃炎(heli cob act erpylori associated gastritis,HAG)脾 胃 湿热证 的小 鼠模型,观察灭幽汤对Keap 1/Nrf2/ARE信号通路中相关蛋白和mRNA表达水平、氧化应激因子等指标的影响,以探究灭幽汤对HAG脾胃湿热证小鼠氧化应激的调控作用。方法:将28只SPF级BALB/c雄性小鼠,随机分成空白组(8只)、模型组(20只)。空白组在常规环境饲养,予以普通饲料自由饮食,模型组给予肥甘饲料自由饮食。同时,空白对照组用布式肉汤0.2selleckchemml/只灌胃,其余模型组用浓度为(1 ×109cfu/ml)的Hp活菌混悬液0.2ml/只灌胃,空白组与模型组均隔日灌胃 1次,共5次。接种后定植14selleckchem Puromycin天,定植期间,模型组继续给予肥甘饲料饲养,空白组予常规方式饲养。造模过程中肉眼观察各组动物的症状(纳呆,便溏或便秘,倦怠)、监测饮水量、饮食量,生存率,体重变化。在实验第3 1天(Hp定植1 4天后),空白组和造模组各随机挑选2只小鼠取胃组织进行快速尿素酶试验、Warthin-Starry银染、HE染色以进行模型鉴定。造模成功后,把模型组18只小鼠随机分为模型对照组(6只)、灭幽汤组(6只)、四联药物组(6只)。灭幽汤组予以灭幽汤(10ml/kg)灌胃,标准四联组予以标准四联混悬液(immediate recall10ml/kg)灌胃,空白组、模型对照组分别以等量蒸馏水灌胃。每只小鼠灌胃体积为10ml/kg,每日给药1次,共给药2周。末次给药后,所有小鼠禁食禁饮30min,而后处死小鼠,取其血清及胃组织标本送检。观察各组小鼠生存率、体重变化,饮食量,饮水量,活动状态、大便性状等情况;苏木素—伊红(HE)染色观察胃黏膜组织病理损伤情况;Elisa法检测血清IL-1 β、IL-18炎性因子的含量;生化检测血清氧化损伤因子丙二醛(MD A),氧化应激保护因子超氧化物歧化酶(SOD)含量;HE及Warthin-Starry银染观察胃黏膜炎症情况;Western-blot检测胃黏膜组织Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表达,RT-PCR检测胃组织中Keap1、Nrf2、HO-1的mRNA的表达变化。结果:1.小鼠一般情况观察:灭幽汤组小鼠、标准四联组小鼠与模型组相比,变化趋势较稳定,纳食、饮水量、精神均可,体重稳步上升,但饮水量绝对值较空白对照组稍低。模型对照组小鼠体重上升趋势最为缓慢,灭幽汤组、标准四联组小鼠接受治疗后体重均明显增加,其中标准四联组小鼠体重增加相对更快。2.W-S银染、快速尿素酶实验提示小鼠成功种植HP。3.HE染色:模型对照组胃粘膜病理损伤明显,而灭幽汤组、标准四联组小鼠胃粘膜炎症反应较模型组明显缓解。4.ELISA检测:空白对照组SOD偏高,而MDA偏低。和空白组相比,模型对照组SOD偏低,而MD A较高。(P<0.0 1);与模型对照组相比,灭幽汤组、标准四联组SOD含量显著增加,而MDA含量显著减少(P<0.01);但灭幽汤组的SOD含量略低于标准四联组(P<0.05),两组间MDA含量差异不显著(P>0.05)。5.PCR检测Keap1、Nrf2、HO-1mRNA的表达:空白对照组Keap1、Nrf2、HO-1mRNA的表达量较模型对照组高(P<0.0 1)。与模型对照组相比,标准四联组Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA表达均显著升高(P<0.01),灭幽汤组Keap1、Nrf2mRNA表达升高(P<0.05)HO-1mRNA表达显著升高(P<0.0 1);但灭幽汤与标准四联组比较,差异不具有统计学意义。(P>0.05)。6:Western-blot检测胃黏膜组织Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表达:四组HO-1蛋白表达量满足正态分布,但不满足方差齐性;采用KW检验,P=0.814>0.05,可认为四个组别之间的小鼠HO-1蛋白表达无明显差异;四组Nrf2蛋白满足正态分布且方差齐,F=0.858,P=0.483>0.05,可认为四组Nrf2蛋白表达无明显差异。四组Keap1蛋白满足正态分布但方差不齐,K-W检验示P=0.005<0.01,各组Keap1蛋白表达有明显差异,两两比较显示,空白对照组与模型对照组之间、灭幽汤组、四联组与模型对照组之间、灭幽汤组和标准四联组之间均无明显差异(P>0.05),灭幽汤组、标准四联组均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HP感染后可诱发小鼠氧化应激反应;灭幽汤能够改善HAG脾胃湿热证小鼠一般情况,从整体上缓解HAG小鼠症状;灭幽汤能提高HAG小鼠Keap1、Nrf2、HO-1mRNA和SOD的表达,降低氧化应激产物MD A的堆积;灭幽汤能通过调控Keap 1-Nrf2-ARE通路,进而抑制HAG脾胃湿热证小鼠氧化应激反应,改善其客观症状和理化指标,从而达到治疗HAG的目的,但本实验并未证实灭幽汤对Keap 1、Nrf2、HO-1蛋白表达进行了干预。

目的 探究牡荆素对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用及其可能的调控机制。方法 将BALB/c裸鼠通过左侧前肢腋窝下接种CNE-2细胞构建鼻咽癌裸鼠成瘤模型，待模型构建成功后随机分为模型组、牡荆素组（5、10 mg/kg）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激动剂组（AICAR,200 mg/kg）、牡荆素+AMPK抑制剂组（Compound C,20 mg/kg），每组各10只。牡荆素组分别按照相应剂量ig;AICAR组ip 200 mg/kg AICAR；牡荆素+Compound C组采取ig 10 mg/kg牡荆素的同时ip 20 mg/kg Compound C，以上各组连续给药21 d。给药结束后测定裸鼠移植瘤体积和质量；苏木素–伊红（HE）染色观察移植瘤组织病理学改变；TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡情况；免疫组织化学检测肿瘤组织微管相关蛋白轻链3(LC3)-II、泛素结合蛋白（p62）蛋白表达；免疫荧光检测肿瘤组织LC3-II和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达；Western blotting检测肿瘤组织Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Casapse-3蛋白及AMPK/UNC-51样激酶1(ULK1)通路相关蛋白相对表达。结果 与模型组相比，牡荆素各剂量组、AICAR组肿瘤生长缓慢，肿瘤体积和质量均显著降低（P<0.05）；肿瘤细胞凋亡率，Caspase-3、LC3-II、BR428使用方法ax/Bcl-2、p-AMPK/AMPK、Berzosertib分子式p-ULK1/ULK1蛋白表达均显著升高，p62蛋白表达均显著降低（P<0.05）。与牡荆素10 mg/kg组相比，牡荆素+Compound C组肿瘤生长良好，肿瘤体积和质量均增加（P<0.05），肿瘤细胞immune parameters凋亡率，Caspase-3、LC3-II、Bax/Bcl-2、p-AMPK/AMPK、P-ULK1/ULK1蛋白表达均显著降低，p62蛋白表达均显著升高（P<0.05）。结论 牡荆素能够抑制鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤生长，其机制与激活AMPK/ULK1通路介导的自噬，促进肿瘤细胞凋亡相关。

目的:探讨睡眠时长与中老年脑小血管病患者神经心理学表现和其脑白质高信号程度相关性,从睡眠角度,为脑小血管病诊治提供参考依据。方法:1、选择2021年11月至2022年11月在南昌大学第二附属医院神经内科住院治疗的96例中老年脑小血管病患者作为研究对象,收集其基本信息及临床资料。使用问卷调查、睡眠相关量表、便捷式睡眠呼吸监测仪评估患者的睡眠情况。使用成套神经心理测试评估患者的神经心理学表现。根据夜间睡眠时长分3组:≤6小时组,(6-9)小时组,≥9小时组;午睡时长分3组:不午睡组,≤1小时组,>1小时组。分析比较:不同夜间/午睡时长的中老年脑小血管病患者睡眠指标的差异和其神经心理学评分的相关性。2、使用磁共振评估患者的脑白质病变,采用Fazekas评分方法将其分为轻度、中度和重度。首先分析睡眠相关参数与其脑白质高信号严重程度的相关性。然后再次根据夜间睡眠时长及午睡时长分组,分析比较:不同夜间/Dorsomorphin价格午睡时长的中老年脑小血管病患者与其白质高信号严重程度的相关性。结果:1、夜间睡眠时长≤6小时组患者匹兹堡睡眠质量指数(Pittsburgh Sleep Quality Index,PSQI)得分较其余两组明显升高(P=0.011,P=0.002),而睡眠效率较其余两组明显降低(P<0.001,P=0.007);且夜间睡眠时长≤6小时组患者失眠严重指数(Insomnia Severity Index,ISI)得分较夜间睡眠时长≥9小时组患者显著升高(P=0.002)。2、不同午睡时长各组睡眠指标之间无统计学差异(P>0.05)。3、夜间睡眠时长为(6-9)小时组患者蒙特利尔认知功能评估量表(Montreal Cognitive Assessment,Mo CA)得分较其余两组均明显升高(P=0.024,P=0.002),画钟测试(Clock Drawing Test,CDT)得分和顺背数字广度测试(Digit Span Test,DST)得分较夜间睡眠时长≥9小时组患者显著升高(P=0.001,P=0.043)。与夜间睡眠时长为(6-9)小时组的患者相比,夜间睡眠时长≥9小时患者的Mo CA评分降低[β(95%CI)=-1.670(-3.371,0.030),P=0.054]。4、夜间睡眠时长≤6小时组患者焦虑自评量表(Self-rating Anxiety Scale,SAS)得分较其余两组明显升高(P=0.003,P=0.004),抑郁自评量表(Self-rating Depression Scale,SDS)得分较夜间睡眠时长(6-9)小时组升高(P=0.036)。与夜间睡眠时长(6-9)小时的患者相比,夜间睡眠时长≤6小时患者SAS得分偏高[β(95%CI)=-1.670(-3.371,0.030),P=0.019]。5、午睡时长≤1小时患者Mo CA评分、听觉词语测验(Auditory Verbal Learning Test,AVLT)得分较其余两组均明显升高(P=0.004,P=0.001),CDT得分较午睡时长>1小时组患者升高(P=0.007)。与午睡时长为≤1小时患者相比,午睡时长>1小时患者Mo CA评分显著降低[β(95%CI)=-5.548(-9.576,-1.300),P=0.011]。6、不同午睡时长与其SAS、SDS得分无统计学意义(P>0.05)。7、睡眠效率与脑白质高信号严重程度呈负相关(r=-0.337,P=0.001),呼吸暂停低通气指数(apnea hypopnea index,AHI)与脑白质高信号严重程度呈正相关(r=0.272,P=0.007)。8、不同夜间/午睡时长与其脑白质高信号严重程度的关联性无统计学意义(P>0.05)。结论:1、在中老年脑小血管病患者中,正常睡眠时长(6-9小时)患者总体认知功能最好,短睡眠时长(≤6小时)或过长睡眠时长(≥9小时)患者认知功能均较其下购买3-Methyladenine降,其中过长睡眠时长(≥9小时)患者认知功能受损更明显,主要表现为视觉空间能力和注意力受损。2、在中老年脑小血管病患者中,与午睡过长(>1小时)和不午睡的人相比,午睡一小时以内的患者总体认知功能水平最高。午睡超过一小时的患者认知功能受损更明显,主要表现为视觉空间能力和记忆学习能力受损。3、在中老年脑小血管病患者中,与正常睡眠时长(6-9小时)患者相比,短睡眠时长(≤6小时)的患者有可能罹患焦虑。4、在中老年脑小血管病患者中,睡眠效率和打鼾与脑白质病变严重程度有关,睡眠时长与脑白质病变严重程度无Wakefulness-promoting medication关。

目的 探讨臭氧暴露诱导卵巢氧化应激及卵泡颗粒细胞凋亡的毒理影响。方法 48只6周龄的无特异性病原体C57BL/6雌鼠随机分为对照组和臭氧暴露组，臭氧暴露组（1.2 mg/m3,10 h）连续暴露30d，对照组于每天的同一时段被放置于同一类型装置中，不发生暴露。实验完成后采集卵巢组织及卵泡颗ABT-263体内实验剂量粒细胞。采用活性氧水平检测方法分析2组小鼠卵巢组织的活性氧水平，采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）(q RT-PCR)测定2组小鼠卵巢炎性因子白细胞介素（IL）-6、 IL-8、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α的mRNA相对表达量，采用蛋白质印迹法检测2组小鼠卵巢组织中凋亡相关蛋白。B淋巴细胞瘤2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3 (Caspase3)、切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-Caspase3)蛋白的表达量，采用流式细胞术测定卵泡颗粒细胞的凋亡状况。结果 与对照组相比，臭氧暴露组中小鼠卵巢组织的活性氧水平升高（t=16.99,P<0.selleck NMR01）；臭氧暴露组中小鼠卵巢组织的炎性因子IL-6(t=10.18,P<0.01)、IL-8(t=19.06,P<0.01)、IL-1β(t=6.39,P<0.01)、TNF-α(t=19.11,P<0.01)的mRNA相对表达水平均降低。与对照组凋亡相关蛋白Bax表达（0.16±0.05）相比，臭氧暴露组中小鼠卵巢组织的Bax表达（0.25±0.06）升高（P<0.01）；与对照组Bcl-2表达（0.212±0.041）相比，暴露组的Bcl-2表达（0.131±0.022）降低（P<0.01）；与对照组Cleaved-Cas-pase3表达（0.120±0.021）相比，暴露组的Cleaved-Caspase3表达（0.192±0.023）升高（P<0.01）。对照组相比，臭氧暴露组中小鼠的卵泡颗粒细胞的凋亡升高。结论 臭氧暴露引起卵巢组织活性氧水平升高，炎性因子IL-6、 IL-AM symbioses8、IL-1β、TNF-α表达降低，卵泡颗粒细胞凋亡增加。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性菌,已经在1994年被列为I类致癌因子。全世界约有50%的人感染H.pylori,H.pylori感染正常胃粘膜细胞后会发展为胃炎、肠化生甚至是胃癌,感染H.pylori十年以上会发展为胃癌。H.pylori通过分泌各种毒力基因适应人类恶劣的胃环境,这些基因使细菌能够在酸性环境中存活,向胃上皮运动,并附着在胃上皮细胞上,引起慢性炎症和组织损伤,最终可能导致胃癌的发生。目前治疗H.pylori主要是使用两种抗生素联合一种质子泵抑制剂和铋剂,然而抗生素治疗始终存在一些副作用并且细菌的耐药性在逐渐提高,因此我们需要开发新方法治疗和预防H.pylori感染。本课题组利用高效液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和一代测序技术对石家庄地区H.pylori表达的外膜蛋白(out membrane protein,OMP)和尿素酶B亚单位(Urease B,UreB)进行鉴定和分析,制备了针对OMP和UreB的单克隆抗体和疫苗。针对OMP和UreB的单克隆抗体在体外能够抑制H.pylori的活性;针对UreB的蛋白疫苗在小鼠体内能够诱导产生T细胞免疫和B细胞免疫,为治疗和预防H.pylori感染提供新的思路。第一部分基于蛋白组学和一代测序技术分析幽门螺杆菌外膜蛋白及尿素酶氨基酸序列变化目的:用高效液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)对从石家庄地区59位幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染者分离菌株的外膜蛋白(out membrane protein,OMP)进行鉴定,分析不同菌株OMP成分中蛋白表达差异;选取一株表达血型抗原结合蛋白A(Blood-group-antigen-binding adhesin,Bab A)菌株进行传代培养,分析传代培养后OMP的表达变化及其致病性改变;用一代测序技术分析石家庄地区不同菌株尿素酶B亚单位(Urease B,UreB)氨基酸序列的多样性,为当地预防和治疗H.pylori提供参考。方法:1.用分区划线分离法培养59株石家庄地区H.pylori菌株,用尿素酶实验和革兰染色方法验证单菌落,用LC-MS实验分析59株菌株的OMP谱的差异。2.选取一株表达Bab A蛋白H.pylori菌株,用分区划线分离法培养,培养48 h为1代,传代至第30代。3.利用传代的第1代和第30代H.pylori分别感染胃癌细胞株AGS和正常胃粘膜上皮细胞株GES-1,用q RT-PCR实验验证传代培养后H.pylori刺激上述细胞产生白介素8(Interleukin 8,IL-8)水平的变化;用细菌粘附实验检测传代培养后H.pylori对AGS和GES-1细胞粘附能力的改变。4.用PCR实验扩增UreBbiomedical materials基因,琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物的长度是否符合预期;用一代测序技术分析比对21株H.pylori中UreB序列,用DNAMAN软件分析21种菌株UreB氨基酸序列的差异。结果:1.分区划线分离法成功培养59株石家庄地区H.pylori菌株,获得单个菌落,尿素酶实验结果为阳性,革兰染色结果显示,单个菌落为红色、杆状,证明单个菌落为H.pylori。2.用LC-MS技术对59株H.pylori菌株OMP进行鉴定,71%(42/59)的菌株检测到表达Bab A;47%(25/59)的菌株表达唾液酸结合粘连蛋白(Sialic acid-binding adhesin,Sab A);37%(22/59)的菌株同时表达Bab A蛋白和Sab A蛋白。3.在H.pylori菌株传代培养至第30代时,与第一代菌株OMP相比,有24种OMP种类均被检出,其中22种OMP的表达量在第30代菌株中降低,2种OMP的表达量在第30代菌株中升高。4.q RT-PCR结果显示,相比于第1代H.pylori,第30代H.pylori刺激AGS分泌IL-8的水平降低(P<0.01);第30代H.pylori刺激GES-1分泌IL-8的水平降低,但是差异不具有统计学意义,提示胃癌细胞可能对H.pylori的刺激更为敏感。5.细菌粘附实验结果显示,相比于第1代H.pylori,第30代H.pylori粘附AGS和GES-1细胞的能力均显著升高(P<0.001,P<0.01)。6.用PCR技术扩增UreB基因,琼脂糖凝胶电泳法分析结果显示,扩增的UreB位置正确,为1056bp,且条带单一;一代测序结果显示,21株H.pylori的UreB DNA序列的同源性为95%;用DNAMAN软件将UreB的DNA序列翻译成蛋白质,氨基酸序列的同源性为98%。小结:本部分实验成功培养了59株H.pylori菌株,不同H.pylori菌株表达的OMP谱不尽相同;H.pylori在传代培养过程中,OMP蛋白种类和表达水平均发生改变,且刺激AGS和GES-1细胞分泌IL-8能力降低,粘附AGS和GES-1细胞的能力显著升高;21株H.pylori的UreB基因DNA序列和氨基酸序列同源性大于95%,表明H.pylori菌株之间UreB基因相对保守,为下一部分实验提供参考。第二部分使用杂交瘤技术制备抗H.pylori Bab A_(385-447)(OMP28)和UreB_(321-339)单克隆抗体并验证抗体的中和能力目的:以H.pylori标准菌株J99 OMP Bab A_(385-447)(OMP28)和UreB_(321-339)为靶点制备多肽,用杂交瘤技术制备单克隆抗体,验证抗体在体外对H.pylori粘附能力和尿素酶活性的影响。方法:1.通过固相N-芴甲氧羰基法合成Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽,用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)鉴定多肽的纯度。2.通过骨髓瘤细胞融合、阳性筛选、亚克隆、小鼠腹水制备、抗体纯化制备针对两种多肽的单克隆抗体。3.用ELISA实验检测单克隆抗体的效价。4.通过尿素酶实验检测针对UreB_(321-339)多肽产生的单克隆抗体抑制尿素酶活性的改变;用细菌粘附实验检测针对Bab A_(385-447)多肽的单克隆抗体抑制H.pylori粘附AGS细胞的作用。5.用ELISA实验检测H.pylori感染者血清中针对Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽的抗体水平。结果:1.通过固相N-芴甲氧羰基法合成Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽,HPLC法分析结果显示,Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽纯度大于90%。2.通过杂交瘤技术制备了针对两种多肽的单克隆抗体;针对Bab A_(385-447)多肽获得了4种确认细节Ig G单克隆抗体;针对UreB_(321-339)多肽获得6种Ig G单克隆抗体。3.ELISA法分析结果显示,针对UreB_(321-339)多肽和Bab A_(385-447)多肽的单克隆抗体效价大于1:100000。尿素酶实验结果表明,当H.pylori和UreB_(321-339)单克隆抗体共孵育4h可抑制H.pylori的活性(P<0.01);粘附实验结果表明,H.pylori和Bab A_(385-447)单克隆抗体共孵育4h可显著抑制H.pylori粘附到AGS细胞的数量(P<0.001)。4.ELISA实验结果表明,H.pylori感染者血清中没有检测到针对Bab A_(385-447)多肽和UreB_(321-339)多肽的抗体。小结:本部分通过杂交瘤技术获得针对Bab A_(385-447)多肽和UreB_(321-339)多肽的Ig G单克隆抗体;抗UreB_(321-339)单克隆抗体和Bab A_(385-447)单克隆抗体在体外能抑制尿素酶活性和H.pylori粘附AGS细胞的能力;在H.pylori感染者血清中没有检测到针对这两种多肽的抗体,表明两种单克隆抗体可作为被动免疫治疗候选制剂。第三部分以H.pylori粘附相关OMP、毒力因子和UreB_(199-338)为抗原制备抗H.pylori多肽疫苗目的:以H.pylori粘附相关的OMP(Bab A、Sab A、Oip A)和毒力因子(Nap A、Cag A、Fla A、GGT、Hpa A、Fec A、Vac A、UreB)为靶点制备粘附因子多肽;以UreB_(199-338)为靶点制备多肽疫苗,并评估重组的UreB_(199-338)蛋白疫苗的免疫原性。方法:1.通过PCR扩增、酶切、酶连、转化、鉴定阳性克隆步骤制备pet28a(+)-粘附因子多肽质粒和p ET-22b(+)-UreB_(199-338)质粒。2.将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导粘附因子多肽和UreB_(199-338)蛋白表达。3.用Ni-NTA亲和层析实验纯化粘附因子多肽和UreB_(199-338)蛋白。4.用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、Western blot和LC-MS技术鉴定纯化的粘附因子多肽和UreB_(199-338)蛋白。5.将佐剂Alum和UreB_(199-338)蛋白按照1:2的体积比混合,皮下免疫BALB/C小鼠100μg Alum-UreB_(199-338)和同体积的Alum,共2针。6.用ELISA实验检测Alum-UreB_(199-338)疫苗最后一次注射后,第21天和第35天BALB/C小鼠体内的抗体水平。7.用抗体粘附实验检测上述抗体抑制H.pylori粘附AGS细胞的变化。结果:1.基因测序结果表明,pet28a(+)-粘附因子多肽和p ET-22b(+)-UreB_(199-338)质粒构建成功。2.粘附因子多肽蛋白的分子量为27.96KD,通过考马斯亮蓝染色在SDS-PAGE胶上检测到25KD-35KD处有明显蓝色条带;Western blot法证实25KD-35KD的条带;LC-MS法分析结果显示,鉴定出的蛋白氨基酸序列跟目的蛋白序列完全匹配,证明纯化的粘附因子多肽蛋白为目标蛋白。3.重组的UreB_(199-338)分子量为16.10KD,通过Ni-NTA亲和层析方法纯化了UreB_(199-338)蛋白,通过考马斯亮蓝染色在SDS-PAGE胶上检测到17KD处有明显蓝色条带;Western blot法证实17KD的条带;LC-MS结果显示,鉴定的蛋白氨基酸序列跟目的蛋白序列匹配,证明纯化的UreB_(199-338)蛋白为目标蛋白。4.ELISA实验结果表明,Alum-UreB_(199-338)疫苗可诱导小鼠产生较高水平的抗UreB_(199-338)抗体。5.抗体中和实验结果显示,含特异性抗体的BALB/C小鼠血清与H.pylori共孵育后,显著抑制H.pylori粘附到AGS细胞的能力(P<0购买Dorsomorphin.001)。小结:本部分制备了重组H.pylori粘附因子多肽蛋白和UreB_(199-338)蛋白,重组H.pylori粘附因子多肽蛋白在大肠杆菌中得到有效表达,重组UreB_(199-338)蛋白疫苗免疫BALB/C小鼠可获得针对UreB_(199-338)的特异性抗体,该抗体在体外可显著降低H.pylori的粘附水平。结论本研究根据石家庄地区H.pylori菌株表达的OMP谱和UreB氨基酸序列制备了抗UreB_(321-339)、Bab A_(385-447)单克隆抗体和粘附因子、UreB_(199-338)蛋白疫苗,两种单克隆抗体在体外能抑制H.pylori尿素酶活性和粘附能力,UreB_(199-338)疫苗能诱导小鼠产生针对UreB_(199-338)抗原的特异性抗体,为进一步预防和治疗H.pylori提供参考。

目的 评估长期暴露于大气细颗粒物(fine particulate matter, PM_(2.5))5种成分(黑炭、铵盐、硝酸盐、有机物、硫酸盐)对肾功能的长期效应。方法 基于中国健康与养老追踪调查寻找更多(China Health and Retirement Longitudinabiogas slurryl Study, CHARLS) 2011年和2015年的数据，纳入5 696名中老年人，使用贝叶斯核机器回归(Bayesian kernel machine regression, BKMR)方法探究黑炭、铵盐、硝酸盐、有机物和硫酸盐5种PM_(2.5)成分对肾功能的单独效应、交互效应和联合效应。结果 2011—2015年慢性肾脏病发生率为5.53%。有机物、黑炭、硝酸盐和硫酸盐的后验包含概率(posterior inclusion probabilities, PIP)值均为1.000,对估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)的影响较大。当其余4种变量固定在第25,50和75百分位时，有机物每增加1个四分位数间距(interquartile range, IQR),估算肾小球滤过率eGFR效应值分别为-9.18(95%CI:-40.16,21.80),-61.57(95%CI:-87.50,-35.64),10.24(95%CI:-16.53, 37.01);黑炭每增加1个IQR,eGFR水平分别上升16.67(95%CI:-12.50,45.84),33.30(95%CI:10.30, 56.30), 53.40(95%CI:25.00, 81.80);硫酸盐每增加1个IQR,eGFR水平与其呈负相关，效应值分别为-89.83(95%CI:-161.17,-18.47),-73.28(95%CI:-102Berzosertib采购.49,-44.47),-22.76(95%CI:-91.42,45.90)。PM_(2.5)组分联合效应与估计肾小球滤过率总体呈负相关。结论 有机物单独暴露与中老年人估计肾小球滤过率水平降低相关，PM_(2.5)混合物与估计肾小球滤过率呈负相关关联，对慢性肾脏病具有正联合影响。

单核细胞和巨噬细胞在健康和疾病中均发挥重要作用，是固有免疫的重要组成，在其介导的炎症反应中保护宿主、清除病原体和调节免疫平衡，可通过清除细胞碎片、异物及调节炎症和愈合过程等维持内环境稳定。根据微环境和细胞激活状态，巨噬细胞可通过改变不同表型影响疾病转归。近二十年人们对胆selleck化学碱能抗炎通路（CAP）在炎症反应中的作用及机制研究越来越深入，尤其是该通路中的重要结构——α7烟碱型乙酰胆NSC 119875临床试验碱受体（α7nAChR），其本质为polymers and biocompatibility神经免疫系统的配体门控离子通道，且在调控单核/巨噬细胞吞噬、趋化因子和细胞因子产生、细胞存活和极化等方面发挥重要作用，相关机制涉及NLRP3炎症小体，可作为多种炎症性疾病的潜在治疗靶点。本文综述α7nAChR在炎症和免疫介导的疾病中对单核/巨噬细胞功能调控和极化的作用。