PDK1信号通路

目的：探索自拟安神方（简称安神方）对大鼠不同脑区5-HT和DA信号通路的影响，揭示安神方抗大鼠心肾不交证失眠的机制。方法：SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组、安神方高、中、低剂量组，每组10只。多因素方法制备改良的心肾不交证失眠大鼠模型，灌胃治疗2周。HE染色观察大鼠脑组织形态结构。高效液相色谱-电化学法（HPLC-ECD）检测大鼠皮质和海马多巴胺（dopamine，DA）和5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的含量。免疫蛋白印迹法检测5-HT信号通路上5-HT1A受体(5-HT_(1A)R)、5-HT2A受体（5-HT_(2A)R）、磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-responseelementbindingprotein，CREB）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和DA信号通路上多巴胺受体D1R1（D_(1)R_(1)）在皮质和海马的表达。结果：HE染色显示模型组大鼠皮质神经元有少量的凋亡，海马结构变化不明显，airway infection安神方能减轻皮质神经元的凋亡。HPLC-ECD结果显示，模型组皮质和海马DA含量均升高（P＜0.05），5-HT的含量均显著下降（P＜0.05），安神方寻找更多显著降低皮质和海Taurine IC50马DA的含量（P＜0.05），同时提高海马5-HT的含量（P＜0.05）。免疫印迹结果显示模型组皮质区大鼠5-HT_(1A)和CREB表达水平降低（P＜0.05），海马区D_(1)R_(1)水平明显升高（P＜0.05），安神方上调皮质5-HT受体5-HT_(1A)蛋白和信号通路上关键蛋白CREB的表达（P＜0.05），并且下调海马受体D_(1)R_(1)的蛋白表达（P＜0.05），其信号通路上CREB受体蛋白表达虽无统计学意义，但各给药组仍有上调趋势。结论：安神方抗心肾不交证失眠的机制可能与抑制皮质神经元凋亡，并促进皮质和海马5-HT通路功能，抑制DA通路功能有关。

目的 探讨前哨淋巴结活检(SLNB)用于Ⅰ、Ⅱa期乳腺癌患者保乳手术的近期效果。方法 回顾性分析2019-09—2021-09长垣县人民医院普通外科行手术治疗的64例Ⅰ～Ⅱa期乳腺癌患者的临床资料。将术中SLNB阴性行保乳手术的患者作为SLNB+保乳术组，将SLNB阳性行保留胸大、小肌的乳腺癌改良根治术患者作为Achincloss组，每组32例。比较2组患者的基线资料和近期治疗效果。结果 2组患者的基线资料差异无统计学意义(P>0.05)。SLNB+保乳术组患者的手术时间、术中出血量，以及术后住院时间、并发症发生率、肩功能优良率、术后6个月www.selleck.cn/products/MG132上臂周径和生活质量SF-36评分等指标均显著优于Achincloss组，差异均有统计学意义(P<0.05)。术后6个月SLNB+保乳术组患者的上臂周径与术前差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SLNB用于Ⅰ、Ⅱa期乳腺癌患者保乳手术，能有效减少术中出血量、缩短手术时间和住院时间、降低并发症发生率，以及提高患者的肩关节Immunomodulatory drugs功能优良率和生活质PEG300体内量，近期效果良好。

目的 明确鱼藤酮对德国小蠊肠道微生物的影响，分析鱼藤酮对德国小蠊胃毒活性低的原因。方法 通过饲喂抗生素清除德国小蠊肠道微生物，然后用鱼藤酮分别饲喂正常德国小蠊和肠道微生物被清除的德国小蠊，检测肠道微生物对鱼藤酮杀虫活性的影响。正常德国小蠊饲喂鱼藤酮后提取肠道基因组DNA，未饲喂鱼藤酮的正常德国小蠊作为对照，利用Illumina Hiseq高通量测序技术测定16S rRNA V3-V4可变区域序列，整理统计测得的序列数目和操作分类单元，分析细菌菌群的组成和丰度、细菌群落的丰富度和多样性，以及菌群组成在不同处理组间的变化。采用SPSS 20.0软件进行数据分析，选取独立样本t检验，利用R语言做聚类热图及主成分分析。结果 与正常德国小蠊相比，肠道微生物被清除的德国小蠊饲喂鱼藤酮后，其存活率显著降低（t=8.485,P<0.001）。16S rRNA测序共检测到19门78科1Eastern Mediterranean28属的细菌。多样性分析结果表明，鱼藤酮处理后德国小蠊肠道微生物ACE指数和Chao1指数均高于对照组（t=-2.990,P=0.040;t=-4.227,P=0.013）。细菌群落丰度结果显示，鱼藤酮处理后德国小蠊线粒体菌科、拟杆菌科和理研菌科的相对丰度均高于对照组（t=-12.178,P<0.001;t=-4.087,P=0.014;t=-3.570,P=0.026）；毛螺菌科、瘤胃菌科、单胞菌科、柄细菌科及肠杆菌科的相对丰度则均低于对照组（t=10.662,P<0.001;t=8.242,P=0.001;t=4.394,P=0.012;t=3.421,P=0.025;t=3.038,P=0.041）。聚类热图分析的结果显示鱼藤酮处理组和对照组处于不同的初级分MK-2206分子量支，主成分分析可https://www.selleck.cn/products/cb-839.html见同一处理的样本间细菌多样性相近。结论 肠道微生物可能在宿主抵御鱼藤酮毒性过程中起一定作用，鱼藤酮对德国小蠊肠道微生物群落结构有较大影响。破坏昆虫肠道微生物群落结构提高杀虫剂杀虫活性可能为植物源农药在害虫防治上的应用提供新的思路。

目的 研究脓毒症并发急性肾损伤（AKI）患者治疗前后血清基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)表达水平变化及其临床意义。方法 选取2021年3月-2022年2月于儋州市人民医院急诊科收治的80例脓毒症患者，根据是否合并AKI分为脓毒症并发急性肾损伤组（S-AKI组）和脓毒症组，均接受脓毒症常规治疗，另选取同期30名体检正常者作为对照组。比较三组血清TIMP-1、基质PLX4032小鼠金属蛋白酶-9(MMP-9)、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、胰岛素样生长因子1(IGF-1)和血管内皮生长因子（VEGF）水平。用Pearson法对血清TIMP-1、MMP-9、BUN、Scr、IGF-1、VEGF水平进行相关性分析。结果 治疗前，S-AKI组TIMP-1、MMP-9、BUN、Scr、IGF-1、VEGF水平均高于脓毒症组（t=4.744、5.635、6.039、7.502、12.514、3.SCH772984试剂711,P均<0.01）和对照组（t=13.396、14.674、17.161、16.560、24.609、29.427,P均<0.001），差异均有统计学意Saxitoxin biosynthesis genes义。治疗后，S-AKI组TIMP-1、MMP-9、IGF-1、VEGF水平均高于对照组（t=3.629、2.829、5.391、12.652,P均<0.001），且脓毒症组高于对照组（t=2.529、2.431、2.817、10.771,P均<0.05），差异均有统计学意义。S-AKI患者TIMP-1水平与BUN、Scr、IGF-1、VEGF水平成正相关（r=0.651、0.670、0.423、0.567,P均<0.05），且MMP-9水平与BUN、Scr、IGF-1、VEGF水平成正相关（r=0.502、0.362、0.415、0.534,P均<0.05）。预后不佳组患者TIMP-1、MMP-9水平均高于预后良好组（t=4.577、5.375,P均<0.001）。结论 S-AKI患者血清TIMP-1、MMP-9高表达，且与肾功能、内皮功能指标相关，对患者预后有一定的预测意义。

目的:挖掘与评价聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂的不良事件(ADE)信号，为临床安全合理用药提供参考。方法:通过访问美国食品药品管理局公共数据开放项目(openFDA)数据库药物不良事件端点，检索2004年1月1日～2022年3月31日PARP抑制剂的ADE报告数据，采用报告比值比(ROR)法和英国药品和保健品管理局的综合标准法(以下简称“MHRA法”)进行风险信号挖掘。结果:获得奥拉帕利、尼拉帕利、卢卡FG-4592采购帕利和他拉唑帕利的ADE报告分别为8 619,13 083,7 352,672份。4种PARP抑制剂的毒性谱存在一定差异。多数ADE与说明书一致。胃肠道毒性IACS-10759价格方面，卢卡帕利及尼拉帕利发生恶心、呕吐、消化不良、便秘等信号强度高于奥拉帕利，其中，尼拉帕利发生便秘(ROR=26.77)和肠梗阻(ROR=11.54)的信号强度较高；奥拉帕利和卢卡帕利会引起肠梗阻(ROR=13.84;ROR=6.21)及腹水(ROR=5.71;ROR=5.87),构成比和关联性均较高，但在说明书中未提及；他拉唑帕利在胃肠系统方面较为安全。血液毒性方面，尼拉帕利发生Plt、WBC、RBC降低等信号强度高于其他三者；奥拉帕利发生骨髓增生异常综合征(MDS)(ROR=43.08)和急性髓细胞白血病(AML)(ROR=37.40)的信号强度较高，他拉唑帕利贫血的信号强度最高(ROR=15.96)。此外，尼拉帕利信号强度较高的有失眠(ROR=13.73)、外周神经病变(ROR=18.38)、味觉障碍(ROR=31.23)等。卢卡帕利和奥拉帕利信号强度较高的分别为肾功能损伤(ROR=61.21)和肺炎(ROR=8.79)。结论:临床应用PARP抑制剂时密切监测患者的血常规、肾功能等指标，关注肺炎、肠梗阻、MDS/AML、便秘等ADE信号，进而有效降低临床用Middle ear pathologies药风险。

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)与食管癌细胞线粒体自噬的相关性，挖掘食管癌治疗新靶点。方法 (1)采用WesterMRTX849体内n blot法检测Pg感染对食管癌细胞线粒体UNC-51-样自噬激活激酶1(ULK1)磷酸化影响，采用免疫组化法检测食管癌组织中Pg表达和ULK1磷酸化水平的相关性；(2)利用Western blot、ICC、ELISA等方法检测Pg感染对食管癌细胞NOD样受体家族成员X1(NLRX1)由胞质向线粒体转位、线粒体自噬及白介素(IL)-6和活性氧(ROS)分泌水平的影响；(3)通过qPCR及RNAscope分别检测线粒体自噬抑制剂及ULK1抑制剂处理对C57小鼠食管组织中和食管鳞状上皮细胞中Pg定植情况的影响。结果 与未处理组相比，食管癌细胞经Pg感染后，其线粒体ULK1的磷酸化水平升高(P<0.01)、NLRX1表达升高(P<0.001)且自噬增强culture media(P<0.001)。动物实验结果表明，与对照组相比，联合干预组可抑制PgLY294002体内实验剂量在小鼠食管组织及食管鳞状上皮细胞中的定植(P<0.001)。结论 Pg通过上调食管癌细胞线粒体ULK1磷酸化水平，从而促进NLRX1由细胞质向线粒体转位，进而诱导线粒体自噬，导致IL-6和ROS分泌减少，最终维持Pg定植。

目的 探讨乳腺癌细胞外泌体对肿瘤相关成纤维细胞激活的诱导作用及机制。方法 (1)将乳腺上皮细胞MCF10A、乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、PBS分别与成纤维细胞MRC-5共培养；另取上述细胞和PBS,在与MRC-5共培养的同时加入外泌体摄取抑制剂GW4869。检测共培养后MRC-5细胞的迁移能力，细胞中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、 IL-8、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子Immunochemicalsβ(TGF-β)、CXC基序趋化因子配体12(CXCL12)、Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)、Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)、Ⅳ型胶原蛋白α1链(COL4A1)的mRNA表达水平。(2)提取MCF10A、MCF-7和MDA-MB-231细胞的外泌体并鉴定，然后将上述细胞外泌体、PBS分别与MRC-5细胞共培养。检测MRC-购买GDC-09735细胞的迁移能力，细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、 TGF-β、 CXCL12、COL1A1、COL3A1、COL4A1的mRNA表达水平，以及细胞中核因子κB(NF-κB)信号通路相关蛋白的表达水平。结果 (1)相较于与PBS或MCF10A细胞共培养的MRC-5细胞，与MCF-7、MDA-MB-231细胞共培养的MRC-5细胞迁移能力提高，IL-1β、IL-6、IL-8、α-SMA、TGF-β、 CXCL12、COL1A1、COL3A1、COL4A1的mRNA表达上调(均P<0.05);加入GW4869共培养后，各组细胞的迁移能力，以及IL-1βBafilomycin A1浓度、IL-6、IL-8、α-SMA、TGF-β、 CXCL12、COL3A1、COL4A1的mRNA表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。(2)相较于与PBS或MCF10A细胞外泌体共培养的MRC-5细胞，与MCF-7、MDA-MB-231细胞外泌体共培养的MRC-5细胞迁移能力提高，IL-1β、IL-6、IL-8、α-SMA、 TGF-β、 CXCL12、COL1A1、COL3A1、COL4A1的mRNA表达上调，且NF-κB磷酸化水平及NF-κB抑制因子α的蛋白表达水平均增加(均P<0.05)。结论 乳腺癌细胞外泌体可能通过激活NF-κB信号通路促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化。

目的 检测甲状腺切除后患者血清促甲状腺激素（TSH）、抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、甲状腺微粒体抗体（TPOAb）表达水平的变化，探讨患者术后发生甲状腺功能减退（简称甲减）的影响因素。方法 选取2017年5月-2021年5月期间在宿州市第一人民医院住院的100例甲状腺疾病患者为研究对象。根据术后复查情况，将患者分为甲减组（n=34）与非甲减组（n=66），比较甲减与非甲减患者间血清TSH、TGAb、TPOAb水平。使用多因素LogisLY2835219分子式tic回归分析患者术后发生甲减的影响因素；受试者工作特征（ROC）曲线分析血清TSH、TGAb、TPOAb水平对患者术后发生甲减的诊断价值。结果 患者进行甲状腺切除术前TSH[(3.98±1.32)μIU/mL vs.(8.42±2.17)μIU/mL]、TGAb[(176.65±38.15)U/mL vs.(89.64±21.43)U/mL]、TPOAb[(189.57±45.86)IU/mL vs.(97.88±26.45)IU/mL]水平与术后比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与非甲减组比较，甲减组患者TSH[(8.42±multi-strain probiotic2.17)μIU/mL vs.(1.97±0.74)μIU/mL]、TGAb[(89.64±21.43)U/mL vs.(38.76±7.84)U/mL]、TPOAb[(97.88±26.45)IU/mL vs.(34.92±6.16)IU/mL]水平显著升高（P均<0.05）。Logistic回归分析显示，手术方式、TSH、TGAb、TPOAb是患者术后发生甲减的危险因素（P<0.05）。ROC曲线分析结果显示，TSH、TGAb、TPOAb联合诊断术后甲减发生的曲线下面积（AUC）为0.832，可提高特异性，但敏感度有所降低。结论 甲状腺切除后患者血清TAlpelisib分子式SH、TGAb、TPOAb水平变化与患者术后是否发生甲减有显著的相关性，对是否发生甲减有一定的诊断价值。

研究背景血管内膜增生是指血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)和细胞外基质病理性地聚集于血管内膜的过程。这种血管重构往往发生在血管损伤之后,多种参与应答的细胞和循环成分被激活,对血管腔进行过度修复。诸多临床过程,如经皮冠状动脉介入术、外科冠状动脉旁路移植术中的静脉移植物、以及血液透析过程中的血管通路,都会带来不同程度的血管损伤,而修复的过程,又往往导致在这些治疗术后一年内出现血管腔再狭窄的现象。VSMCs在血管内膜增生的过程中扮演着十分重要的角色。当血管发生损伤后,被激活的炎性细胞和功能紊乱的内皮细胞释放出大量的活性因子,如血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF),促进平滑肌细胞的增殖,进而促进其从血管中膜向血管内膜迁移沉积,形成病理性的增生内膜。既往研究表明,内膜增生的过程受到一系列因子的调控,其中包括信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)。当 VSMCs 受到细胞因子或生长因子的刺激,STAT3被磷酸化,并以磷酸二聚体的形式从细胞质转移至细胞核中,调控包括增殖和迁移在内的相关靶基因的表达。干扰STAT3基因或采用STAT3抑制剂均可抑制VSMCs的增殖和迁移,进而减轻血管内膜增生的程度。尽管STAT3能够促进血管内膜增生的作用已经明确,但是在此病理过程中,STAT3的表达和功能如何被调控还需更深层的研究。果蝇幼虫巨大致死基因1(lethal giant larvae 1,LGL1)因首次发现于果蝇中而得名,该基因可以编码一系列高度保守的蛋白。在既往研究中,LGL1对于维持细胞的极性和稳定性有着重要的作用;此外,它还能够作为肿瘤抑制因子,在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用。在我们近期的研究中,LGL1能够通过高迁移率族蛋白B1抑制血管钙化。然而,LGL1在血管损伤导致的内膜增生中发挥的作用,还未有研究阐述。因此,本研究采用平滑肌特异性敲除LGL1(LGL1SMKO)小鼠探究LGL1在血管内膜增生过程中的作用,并探索其具体机制,为寻找血管损伤后重塑的可能干预靶点提供新的思路。论文I LGL1在平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及机制研究研究目的1.明确病理性增殖刺激下VSMCs中LGL1的表达变化;2.探究LGL1对VSMCs增殖和迁移功能的影响;3.探讨LGL1调控VSMCs增殖和迁移的具体作用机制。研究方法1.小鼠原代主动脉VSMCs的提取和鉴定采用LGL1flox/flox小鼠与α-SMA启动子调控的Cre(α-SMA-Cre)小鼠杂交,繁育平滑肌特异性LGL1敲除小鼠,即LGL1SMKO小鼠。同窝出生的LGL1flox/flox/Cre-小鼠作为对照组(control,CTR)。选取4-6周龄小鼠,用组织块贴壁法提取小鼠原代主动脉VSMCs,并采用细selleck抑制剂胞免疫荧光技术检测平滑肌细胞标志物(SM22α、α-SMA)在所提取细胞中的表达。2.探究病理性增殖刺激下VSMCs中LGL1的表达变化使用 20ng/mL PDGF-BB 对 VSMCs 进行 0h、12h、24h、48h 和 72h 的时间梯度刺激,Western Blot和qRT-PCR分别检测LGL1蛋白和mRNA含量。3.探究LGL1过表达对VSMCs增殖和迁移功能的影响培养VSMCs,分别感染LGL1过表达腺病毒和GFP腺病毒,后用PDGF-BB(20ng/mL)和等剂量Vehicle(PBS)作为对照刺激VSMCs48h。细胞分为以下4组:① GFP+Vehicle;② LGL1+Vehicle;③GFP+PDGF-BB;④ LGL1+PDGF-BB。Western Blot和qRT-PCR分别检测细胞周期相关分子Cyclin D1和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白及 mRNA 水平,CCK8实验评价细胞增殖能力,伤口愈合实验衡量细胞迁移能力。4.探究LGL1缺失对VSMCs增殖和迁移功能的影响对CTR和LGL1SMKO组原代VSMCs给予PDGF-BB(20ng/mL)和等剂量Vehicle(PBS)作为对照刺激48h。细胞分为以下4组:①CTR+Vehicle;②LGL1SMKO+Vehicle;③ CTR+PDGF-BB;④ LGL1SMKO+PDGF-BB。WesternBlot和qRT-PCR分别检测增殖相关分子Cyclin D1和PCNA蛋白及mRNA水平,CCK8实验评价细胞增殖能力,伤口愈合实验衡量细胞迁移能力。5.探究LGL1对STAT3的调节作用在 VSMCs 中过表达 LGL1,Western Blot 检测 STAT3 和 P-STAT3(Y705)的蛋白含量;qRT-PCR检测STAT3的mRNA水平;免疫共沉淀实验明确LGL1是否能与STAT3结合;应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)、溶酶体酶抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)和蛋白酶体抑制剂MG132进行蛋白质降解途径实验,确定LGL1通过何种方式影响STAT3的降解。6.探究STAT3在LGL1调控VSMCs增殖和迁移中的作用对 CTR 和 LGL1SMKO 原代 VSMCs 使用 STAT3 抑制剂 SH-4-54(10μM)及其等剂量Vehicle(DMSO)预处理24h,再加入PDGF-BB(20ng/mL)及其等剂量 Vehicle(PBS)刺激 48h。细胞分为以下 8 组:①CTR+Vehicle+Vehicle;②LGL1SMKO+Vehicle+Vehicle;③CTR+Vehicle+SH-4-54;④ LGL1SMKO+Vehicle+SH-4-54;⑤ CTR+PDGF-BB+Vehicle;⑥ LGL1SMKO+PDGF-BB+Vehicle;⑦ CTR+PDGF-BB+SH-4-54;⑧ LGL1SMKO+ PDGF-BB+SH-4-54。Western Blot和qRT-PCR分别检测增殖相关分子Cyclin D1和PCNA蛋白及mRNA水平,CCK8实验评价细胞增殖能力,伤口愈合实验衡量细胞迁移能力。7.统计学分析所有计量数据均以均数±标准误(mean±SEM)的形式表示。采用Klomogorov-Smirnov检验对计量数据进行正态性检验;采用非配对Student t检验进行两组间的比较;采用单因素方差分析对单变量引起的多组间差异进行比较,并采用Bonferroni事后检验进行两两对比。P<0.05被视为有统计学差异。研究结果1.PDGF-BB抑制VSMCs中LGL1的表达Western Blot和qRT-PCR检测在PDGF-BB时间梯度刺激下VSMCs中LGL1的表达量。结果表明,在PDGF-BB的作用下,VSMCs中LGL1的蛋白和mRNA水平均呈下降趋势,且含量随PDGF-BB作用时间的增加而降低。2.LGL1过表达抑制VSMCs的增殖和迁移Western Blot和qRT-PCR结果显示,PDGF-BB可以增加细胞增殖标志物Cyclin D1和PCNA的蛋白和mRNA表达,而过表达LGL1可抑制Cyclin D1和PCNA的蛋白和mRNA表达水平的上调。CCK-8法检测结果表明LGL1过表达能够抑制VSMCs的增殖能力。此外,伤口愈合实验结果证明,LGL1过表达可以显著抑制VSMCs的迁移能力。3.LGL1敲除促进VSMCs的增殖和迁移与CTR组相比,LGL1SMKO组VSMCs中Cyclin D1和PCNA的蛋白及mRNA含量均上调,LGL1缺失加剧了 PDGF-BB引起的细胞周期相关因子表达水平的升高。细胞增殖实验和伤口愈合实验的结果分别表明了 LGL1敲除能够促进VSMCs的增殖能力和迁移能力。4.LGL1能够与STAT3结合并促进其降解Western Blot和qRT-PCR结果显示,VSMCs过表达LGL1可下调STAT3和P-STAT3(Y705)的蛋白含量,但不影响STAT3的mRNA水平。免疫共沉淀结果表明,LGL1能够与STAT3结合。蛋白酶体抑制剂MG132可显著抑制LGL1过表达引起的STAT3蛋白水平下调,而自噬抑制剂3-MA或溶酶体酶抑制剂CQ则不能引起这种改变,说明LGL1通过蛋白酶体途径促进了 STAT3的降解。5.LGL1通过STAT3抑制VSMCs的增殖和迁移Western Blot和qRT-PCR结果表明,STAT3抑制剂SH-4-54能够抑制LGL1敲除引起的VSMCs中Cyclin D1和PCNA蛋白及mRNA表达量的增加。CCK-8检测显示,SH-4-54能够抑制LGL1敲除引起的VSMCs增殖能力的增强。而伤口愈合实验的结果则证实SH-4-54能显著减弱LGL1敲除引起的VSMCs迁移能力的增强。以上结果说明,LGL1通过STAT3抑制VSMCs的增殖和迁移。结论1.PDGF-BB抑制VSMCs中LGL1的表达水平;2.在VSMCs中过表达LGL1,能降低细胞周期相关蛋白的表达,抑制平滑肌细胞的增殖和迁移功能;3.在VSMCs中敲除LGL1,可增加细胞周期相关蛋白的表达,促进平滑肌细胞的增殖和迁移功能;4.LGL1减少STAT3蛋白含量而不影响STAT3 mRNA水平,该作用是通过与STAT3结合,并经由蛋白酶体途径促进后者降解;5.在VSMCs中抑制STAT3,可明显减弱由LGL1缺失引起的平滑肌细胞增殖和迁移功能的增强。论文Ⅱ LGL1在小鼠血管内膜增生模型中的作用及机制研究研究目的1.在体内明确血管损伤后重塑过程中LGL1的表达PS-341核磁变化;2.探究血管平滑肌LGL1对血管内膜增生的影响;3.在体内验证血管平滑肌LGL1调控血管内膜增生的具体机制。研究方法1.小鼠血管内膜增生模型构建采用LGL1flox/flox小鼠与α-SMA启动子调控的Cre(α-SMA-Cre)小鼠杂交,繁育平滑肌特异性LGL1敲除小鼠,即LGL1SMKO小鼠。同窝出生的LGL1flox/flox/Cre-小鼠作为对照组(control,CTR)。通过免疫荧光共定位染色(α-SMA,LGL1)鉴定小鼠血管中平滑肌LGL1基因表达Bioclimatic architecture。8周龄小鼠通过左颈总动脉(left common carotid artery,LCCA)结扎术构建血管内膜增生模型,记为Ligated。右侧颈总动脉(right common carotid artery,RCCA)除结扎外与左侧颈总动脉做相同处理,作为自体对照(Sham)。术后正常喂养3周后取材。2.探究血管内膜增生过程中血管LGL1表达的变化对8周龄野生型小鼠进行LCCA结扎术造模,RCCA为对照,3周后取材。Western Blot和免疫组织化学染色检测结扎组和未结扎组中LGL1的蛋白表达变化,qRT-PCR检测两组中LGL1的mRNA含量变化。实验分为Sham组和Ligated组。3.探究血管平滑肌LGL1在小鼠血管内膜增生中的作用对8周龄CTR小鼠和LGL1SMKO小鼠进行LCCA结扎术造模,RCCA为对照,3周后取材。Western Blot和免疫组织化学染色检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1和PCNA的变化。对颈总动脉横切面行HE染色观察血管内膜增生的程度。实验分组如下:①CTR+Sham 组;②LGL1SMKO+Sham 组;③CTR+Ligated组;④LGL1SMKO+Ligated 组。4.验证LGL1通过STAT3抑制小鼠血管内膜增生对8周龄CTR小鼠和LGL1SMKO小鼠进行LCCA造模,RCCA为对照,同时腹腔注射STAT3抑制剂SH-4-54(10mg/Kg/天)或等剂量Vehicle,3周后取材。对颈总动脉横切面行HE染色观察血管内膜增生的程度。实验分组如下:①CTR+Vehicle+Sham 组;② LGL1SMKO+Vehicle+Sham 组;③ CTR+SH-4-54+Sham 组;④LGLlSMKO+SH-4-54+Sham 组;⑤CTR+Vehicle+Ligated 组;⑥LGL1SMKO+Vehicle+Ligated 组;⑦CTR+SH-4-54+Ligated 组;⑧LGL1SMKO+SH-4-54+Ligated 组。5.统计学分析同论文Ⅰ。研究结果1.血管内膜增生过程中LGL1表达下降Western Blot和qRT-PCR结果显示,与Sham组相比,Ligated组的LGL1蛋白及mRNA含量均降低。免疫组织化学染色检测结果亦表明血管内膜增生过程中LGL1表达下降。2.平滑肌细胞特异性敲除LGL1促进血管内膜增生Western Blot和免疫组织化学染色检测结果表明,与Sham组相比,Ligated组的血管Cyclin D1和PCNA的蛋白表达量均明显升高,而平滑肌特异性敲除LGL1进一步促进了血管内膜增生过程中细胞周期相关蛋白的表达上调。HE染色结果显示LGL1SMKO组相较于CTR组,病理性血管增生内膜面积显著增加,内膜中膜比显著上升。3.LGL1通过STAT3抑制小鼠血管内膜增生通过HE染色显示颈总动脉形态学变化和内膜增生情况,结果显示,与Vehicle组相比,给予STAT3抑制剂SH-4-54注射的小鼠血管增生内膜面积和内膜中膜比显著减少,SH-4-54能够显著缓解由平滑肌LGL1缺失引起的小鼠血管内膜增生病变。结论1.小鼠血管内膜增生过程中血管LGL1蛋白和mRNA的表达水平下降;2.平滑肌特异性敲除LGL1能够促进损伤后血管内膜增生和管腔再狭窄;3.LGL1通过STAT3调控血管内膜增生过程,在小鼠体内应用STAT3抑制剂可明显减轻由LGL1SMKO引起的血管内膜增生和重塑。

目的 探究miR-30a-5p在人乳腺癌MCF-7细胞对他莫昔芬(tamoxifen,TAM)耐药性中的作用，并阐明相关作用机制。方法 通过短时间高浓度TAM刺激MCF-7细胞诱导耐药株，MTT法检测细胞耐药性的改变；qRT-PCR法检测MCF-7细胞及其耐药细胞株MCF-7/TAM中miR-30a-5p的表达情况；吖啶橙染色及Western blotting检测MCF-7/TAM细胞相对于MCF-7细胞自噬的变化；转染miR-30a-5p模拟物后，采用MTT法检测MCF-7/TAM细胞对TAM敏感性的变化，并通过吖啶橙染色和Western bloBio-compatible polymertting观察miR-3TGF-beta/Smad抑制剂0a-5p对MCF-7/TAM细胞自噬的影响；采用生物信息学方法对miR-30a-5p进行靶基因预测，荧光素酶报告基因试验验证miR-30a-5p对ATG5的靶向调控作用；Western blotting检测miR-30a-5p对ATG5表达的寻找更多影响。结果 TAM对MCF-7/TAM细胞的抑制作用明显弱于对MCF-7细胞；miR-30a-5p在MCF-7/TAM细胞中的表达水平明显低于在MCF-7细胞中；相对于MCF-7细胞，MCF-7/TAM细胞的自噬水平明显升高；过表达mi R-30a-5p后，MCF-7/TAM细胞对TAM敏感性显著增加，自噬水平显著降低；Targetscan软件分析表明ATG5是miR-30a-5p的下游靶基因，通过荧光素酶报告基因试验进一步证明miR-30a-5p靶向调控ATG5;MCF-7/TAM细胞中上调miR-30a-5p能够抑制ATG5的表达。结论 miR-30a-5p靶向调控ATG5，并能够抑制细胞的自噬，进而增强乳腺癌细胞对TAM的敏感性。