目的:本研究以糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)临床患者、糖尿病肾病模型小鼠和人肾小管细胞等为研究对象,探讨发育及DNA损伤反应调节基因1(regulated in development and DNA damage responses1,REDD1)在糖尿病肾病中的作用及可能机制,并通过敲低REDD1改善糖尿病肾病肾小管细胞凋亡、转分化及脂质沉积的情况,为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制和探索糖尿病肾病潜在的治疗靶点提供实验依据。方法:1.观察REDD1在糖尿病肾病患者和小鼠肾组织的表达情况及意义。(1)REDD1在糖尿病肾病患者肾组织的表达情况及意义。收集2017年1月～2019年10月在河北医科大学第二医院肾内科住院,经病史采集、临床化验室检查及肾穿刺活检病理学诊断为糖尿病肾病患者40例。血糖正常的肾脏肿瘤患者10例作为对照组。收集所有患者的详细临床资料,包括年龄、性别、身高、体重、病程、血压、服药史,同时留取血标本检测患者临床指标。所有的肾组织标本经过脱水,石蜡包埋,切片后进行常规病理染色,以及免疫组织化学检测REDD1的表达情况。油红O染色观察糖尿病肾病患者肾组织内脂滴沉积情况。TUNEL染色观察糖尿病肾病患者肾组织内细胞凋亡情况。分析糖尿病肾病患者肾组织内REDD1表达情况与细胞凋亡和脂质沉积的关系。(2)REDD1在糖尿病肾病小鼠肾组织的表达情况及意义。利用16周C57BL/ks背景的db/db小鼠和同样背景的同窝对照db/m小鼠。采用免疫组织化学的方法检测REDD1在各组小鼠肾组织的表达情况。油红O染色观察小鼠肾组织内脂滴沉积情况。TUNEL染色观察小鼠肾组织内细胞凋亡情况。分析小鼠肾组织内REDD1表达情况与细胞凋亡和脂质沉积的关系2.采用注射腺病毒的技术将C57BL/ks小鼠REDD1基因敲低。实验分组为:db/m小鼠8只、db/db小鼠24只随机分为三组:db/db组、db/db+空载病毒对照组(db/db+B)、db/db+REDD1sh RNA腺病毒AAV9注射组(db/db+AV)。Western blot检测凋亡相关的蛋白(Bax、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3)、氧化应激水平(Nox4)、脂肪酸合成相关蛋白(SREBP-1、ACC和FASN)、脂肪酸β氧化的相关蛋ICI 46474化学结构白(PPARα、ACOX1和CPT1)、上皮细胞转分化相关蛋白(α-SMA和E-cadherin)的表达水平。免疫组化检测各组小鼠肾脏Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、SREBP-1、FASN、ACC、PPARα、ACOX1、CPT1的定位和表达。油红O染色方法检测各组小鼠脂质沉积情况。3.HK-2细胞为实验对象,高浓度葡萄糖孵育HK-2细胞6、12、24、48和72小时。细胞分三组:正常浓度葡萄糖组(NG)、高渗透压组(M)和高浓度葡萄糖组(HG)。Western blot、RT-q PCR和细胞免疫荧光检测REDD1在HK-2细胞内蛋白和m RNA的表达水平及定位。转染REDD1si RNA且高浓度葡萄糖刺激HK-2细胞48小时后开展实验。实验分组为:正常浓度葡萄糖组(NG)、高浓度葡萄糖组(HG)、高浓度葡萄糖+空载质粒对照组(HG+C)和高浓度葡萄糖+REDD1 si RNA转染组(HG+si REDD1)。TUNEL检测各组细胞凋亡情况。DCFH-DA和Mito SOX染色通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测ROS的水平。油红O检测细胞内脂质沉积情况。Western blot检测细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3)、氧化应激水平(Nox4)、脂肪酸合成相关蛋白(SREBP-1、ACC和FASN)、脂肪酸β氧化的相关蛋白(PPARα、ACOX1和CPT1)、上皮细胞转分化相关蛋白(α-SMA和E-cadherin)的表达。免疫荧光检测REDD1、SREBP-1、CPT1、α-SMA和E-cadherin的表达水平。RT-q PCR检测REDD1、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3、α-SMA和E-cadherin m RNA的表达水平。在倒置显微镜下观察各组HK-2细胞的形态。结果:1.REDD1在糖尿病肾病患者、小鼠和HK-2细胞的表达及意义(1)免疫组化显示:REDD1在糖尿病肾病患者和db/db小鼠肾小管细胞中表达均增多。Western blot及RT-q PCR结果显示,高糖可以刺激REDD1表达增多,并且表现为时间依赖性。(2)REDD1的表达增多与糖尿病肾病患者和db/db小鼠血Scr、TC和TG均呈正相关。REDD1的表达增多与糖尿病肾病患者血β2MG和cystatin-C呈正相关。(3)medial rotating kneeREDD1的表达增多与糖尿病肾病患者和db/db小鼠肾组织凋亡、纤维化和脂质沉积有相关性。REDD1的表达增多与HK-2细胞凋亡、转分化和脂质沉积有相关性。2.敲低REDD1对糖尿病肾病小鼠和高浓度葡萄糖诱导HK-2细胞凋亡及转分化的影响及作用机制(1)免疫组化及Western blot结果显示敲低REDD1可以下调糖尿病肾病小鼠Bax和Cleaved-Caspase 3的表达,而Bcl-2的表达上调。高浓度葡萄糖刺激的HK-2细胞,转染REDD1 si RNA可以减少细胞的凋亡数目,并且减少Bax/Bcl-2蛋白比例和下调Cleaved-Caspase 3的表达水平。(2)Western blot及免疫组化结果显示:与db/db小鼠相比,REDD1敲低糖尿病肾病小鼠α-SMA的表达下降,E-cadherin的表达升高。HK-2细胞的实验结果与糖尿病肾病小鼠的结果相一致。(3)REDD1si RNA显著降低高浓度葡萄糖刺激下HK-2细胞Nox4的表达和ROS的产生。(4)抗氧化药物(NAC或Tempol)可以改善高浓度葡萄糖诱导的HK-2细胞REDD1表达增加。3.REDD1在糖尿病肾病肾脏细胞脂质代谢紊乱中的作用及机制(1)在REDD1敲低的糖尿病肾病小鼠肾脏内脂滴蓄积减少且SREBP-1、ACC和FASN表达减少。(2)PPARα、ACOX1和CPT1的表达在REDD1敲低的糖尿病肾病小鼠肾脏中升高。(3)REDD1 si RNA可以减少高浓度葡萄糖刺激的HK-2细胞内脂滴聚集,并下调SREBP-1、ACC和FASN的水平。(4)REDD1 si RNA可以增加高浓度葡萄糖刺激的HK-2细胞内PPARα、ACOX获悉更多1和CPT1水平。(5)REDD1基因敲低影响糖尿病肾病小鼠内MAMs和线粒体内ATP的生成,此外高浓度葡萄糖诱导的HK-2细胞转染REDD1 si RNA后线粒体功能受损得到改善。(6)REDD1si RNA可以抑制足细胞内ChREBP表达。敲低足细胞ChREBP基因可以下调ACC和FASN的水平;增加PPARα、ACOX1和CPT1水平。结论:1.在糖尿病肾病患者和小鼠的肾组织中均发现REDD1在肾小管细胞表达增加,同时高糖培养的HK-2细胞中REDD1明显升高,提示REDD1可能参与了糖尿病肾病肾小管上皮细胞损伤过程。2.敲低REDD1可缓解糖尿病肾病肾小管细胞凋亡和转分化。这一过程可能是REDD1通过与TXNIP结合形成复合体引起氧化应激激活导致的。3.REDD1可能通过改变MAMs和线粒体功能,及调节ChREBP引起糖尿病肾病肾脏细胞脂质沉积。