新冠病毒SARS-CoV-2对细胞的侵染依赖于病毒表面衣壳蛋白Spike与受体细胞的膜蛋白ACE2的结合与活化。当病毒颗粒与细胞融合时候,即病毒外壳刺突蛋白S结合细胞受体血管紧张素转化酶ACE2,经过丝氨酸蛋白酶TMPRSS2活化从而触发病毒颗粒与细胞膜融合。TMPRSS2是一种跨膜丝氨酸蛋白酶,广泛分布于肺、小肠和肾脏等组织上皮细胞。它在SARS-CoV-2(新冠病毒)侵入宿主细胞时,TMPRSS2负责将Spike蛋白在S2位点进行切割,以活化S蛋白并释放S2亚基的融合肽结构域,从而促进细胞与病毒的融合。由于TMPRSS2在新冠病毒细胞侵染时非常BMS-354825小鼠重要,因此,有效抑制TMPRSS2的活性成为阻断病毒入侵宿主细胞的有效策略。α-1抗胰蛋白酶(α1AT)是由SERPINA1基因编码的重要的蛋白酶抑制剂Severe and critical infections,抑制蛋白酶活性,具有调控炎症、脂代谢以及抗病毒等多种功能。最新的研究发现,α1AT具有优异的抗SARS-CoV-2作用,该作用与α1AT抑制跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)的活性有关,但其具体机理尚不清楚。本论文拟通过体外表达α1AT和TMPRSS2,构建体外催化与抑制体系,从分子水平验证α1AT对TMPRSS2的抑制效果,解释其抑制机理。通过对α1AT的改进获得更优的抑制剂,为新的抗病毒药提供理论支持。本论文工作分两部分:一、TMPRSS2的可溶性表达。二、通过分子对接和生物计算的方法,模拟了 α1AT抑制TMPRSS2的分子过程以及发挥功能的关键位点,并通过突变获得了抑制效率提高1.5倍的突变体。具体内容如下:(1)TMPRSS2基因的原核表达及表达条件优化:将TMPRSS2基因与含有不同助溶标签(GST、SUMO、MBP、XXA)的载体连接并转入BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,确定最佳诱导条件。结果显示,人工融合肽XXA相对于其他助溶标签在促进蛋白质的表达和正确折叠方面具有压倒性的优势。(2)重组 XXA-TMPRSS2、ΔXXA-TMPRSS2(XXA 切割后的 TMPRSS2)的酶学性质表征:包括最适pH、温度稳定性、pH稳定性、酶动力学参数的测定等。结果显示,具有XXA标签的重组TMPRSS2显示出与其天然对应物相同的酶性质,同时在高温环境中更加稳定。(3)α1AT基因的原核表达及表达条件优化:将α获悉更多1AT基因与载体pET28a连接,为方便后期的蛋白质纯化,在含有394个氨基酸残基的α1AT蛋白的-N-末端和-C-末端连接6个组氨酸的纯化标签(His-Tag)。质粒转化E.coli,经过IPTG诱导表达之后检测细胞裂解液上清。通过免疫印迹技术,使用His-tag特异性抗体检测到重组蛋白α1AT-his,确认蛋白分子量显示略小于50kD。(4)在结构信息指导下的对α1AT氨基酸残基突变位点进行突变,检测相关突变体对TMPRSS2酶学性质的影响。通过结果分析筛选出3个α1AT的突变点(P357W、M358H和S359R),在体外通过比较突变体与野生型α1AT蛋白对TMPRSS2酶活的抑制效率,发现S359R突变体的抑制效果比野生型提高了 1.5倍。