镍是一种对动物和人类具有毒害作用的重金属,广泛用于冶金和生活用品中。硫氧还蛋白还原酶3(Txnrd3)以硫氧还蛋白为主要的反应底物,参与细胞增殖代谢、氧化还原和凋亡等多种过程,在肝脏、心脏及脾脏中都发挥重要的生物学功能。而褪黑素又是公认的抗氧化剂,具有良好的抗氧化和抗凋亡功能。本研究通过建立体内镍(Ni)暴露诱导小鼠肾脏病变模型、敲除Txnrd3后对镍诱导的肾脏损伤作用情况及褪黑素(Mel)对镍暴露的作用情况探讨Txnrd3对镍诱导的小鼠肾脏损伤的作用以及褪黑素的缓解作用。实验用鼠被分为八组:分别为野生型对照组(Wild-NC),野生型给镍组(Wild-Ni),野生型褪黑素组(Wild-Mel)、野生型镍和褪黑素组(Wild-Ni+Mel),Txnrd3~(-/-)对照组(Txnrd3~(-/-)Dorsomorphin–寻找更多NC),Txnrd3~(-/-)镍处理组(Txnrd3~(-/-)-Ni),Txnrd3~(-/-)褪黑素处理组(Txnrd3~(-/-)-Mel),Txnrd3~(-/-)镍和褪黑素处理组(Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel)。小鼠的给药浓度:NiCl_2为10 mg/kg,Mel为2 mg/kg,均采取灌胃给药的方式,两者给药时间间隔8 h,早上灌服氯化镍溶液,晚上灌服褪黑素,对照组灌服生理盐水,给药周期为21 d。对小鼠肾脏组织进行超微结构观察,并结合TUNEL染色结果共同分析肾脏凋亡情况,采取q RT-PCR和Western Blot分析线粒体凋亡的相关基因表达情况,以探讨Txnrd3在镍诱导的小鼠肾脏凋亡中的作用和褪黑素的改善情况。研究结果如下:(1)超微结构观察显示,镍暴露会造成小鼠肾脏细胞的细胞核明显发生萎缩,Wild-Ni组小鼠肾脏出现线粒体嵴断裂、空泡化明显等症状,发生明显的线粒体凋亡特征。而敲除Txnrd3后Txnrd3~(-/-)-Ni组细胞核皱缩加剧严重,染色质出现聚集,线粒体空泡化程度较Ni组加重,线粒体凋亡情况进一步增加。Txnrd3~(-/-)-NC组病理变化与Wild-NC组无明显差异;H&E组织病理学检查结果观察表明Wild-Ni组肾脏出现肾小球变性,肾小管萎缩;Wild-Mel组与Wild-NC组H&E染色结果无明显变化,Wild-Ni+Mel组肾小球萎缩和肾小管变性较Wild-Ni组情况减缓;Txnrd3~(-/-)-NC组肾脏无明显病理变化,H&E染色结果与Wild-NC无差异;Txnrd3~(-/-)-Ni组肾小球进一步萎缩,肾小管变性明显,较Wild-Ni组病变严重;Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel组肾小球和肾小管的变性较Txnrd3~(-/-)-Ni组有所缓解,但缓解程度不如Wild-Ni+Mel组。(2)TUNEL结果也表明,镍处理组小鼠,绿色荧光区域增多,发生凋亡,Txnrd3~(-/-)-Ni组这一现象加剧,绿色荧光区域变大,凋亡进一步加剧,Txnrd3~(-/-)-NC组与Wild-NC组无明显差异。这结果也证实了Txnrd3对小鼠肾脏有重要作用,敲除Txnrd3后小鼠肾脏受到镍暴露造成的损伤加剧,褪黑素可以缓解损伤情况。(3)氧化应激试剂盒检测结果表明Wild-Ni组的T-AOC、SOD、GSH活性显著降低,MDA含量显著升高(p<0.01),Wild-Ni+Mel组T-AOC、SOD、GSH活性较Wild-Ni组显著升高但仍低于Wild-NC组,MDA含量较Wild-Ni组显著降低(p<0.01);Txnrd3~(-/-)-Ni组T-AOC、SOD、GSH活性显著下调,MDA含量显著上调(p<0.01);Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel组上述氧化应激指标发生逆转;Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel组T-AOC、SOD、GSH较Wild-Ni+Mel组显著降低,MDA显著升高(p<0.01)。(4)检测小鼠肾脏组织中与线粒体相关的基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9和Cyt-c的m RNA水平表达情况,结果显示:Wild-Ni组Bax、Caspase-3、Caspase-9和Cyt-c的m RNA含量显著上升,Bcl-2的m RNA含量显著降低(p<0.01),WiMedical translation application softwareld-Ni+Mel组的这些基因的表达情况有所逆转(p<0.01),Wild-NC组和Wild-Mel组的上述基因表达含量无明显差异(p>0.05)。Txnrd3~(-/-)-Ni组Bax、Caspase-3,Caspase-9和Cyt-c的m RNA的表达显著高于Txnrd3~(-/-)-NC组(p<0.01),Bcl-2的m RNA含量显著降低(p<0.01),Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel上述基因较Txnrd3~(-/-)-Ni组有所逆转,变化差异显著(p<0.01);Txnrd3~(-/-)-Mel组与Txnrd3~(-/-)-NC组的Bcl-2、Cyt-c和Caspase-3的m RNA含量无显著差异(p>0.05);Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel组的Bax、Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9的m RNA表达含量高于Wild-Ni+Mel组,Bcl-2含量较Wild-Ni+Mel组显著降低(p<0.01)。(5)检测小鼠肾脏组织中与线粒体相关的基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9和Cyt-c的蛋白表达情况,结果显示:Wild-Ni组Bax、Caspase-3、Caspase-9和Cyt-c的蛋白含量表达上调,Bcl-2的蛋白表达显著下调(p<0.01),与Wild-Ni相比,Wild-Ni+Mel组的这些蛋白的表达情况有所逆转,差异显著(p<0.01),Wild-NC组与Wild-Mel组的上述基因表达含量无明显差异(p>0.05)。Txnrd3~(-/-)-Ni组Bax、Caspase-3,Caspase-9和Cyt-c的蛋白表达显著高于Txnrd3~(-/-)-NC组,Bcl-2的蛋白表达显著降低(p<0.01);Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel组的上述基因较Txnrd3~(-/-)-Ni组有所逆转,变化差异显著(p<0.01);Txnrd3~(-/-)-Mel组的Bax、Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达较Txnrd3~(-/-)-NC组显著降低(p<0.01);Txnrd3~(-/-)-Ni+Mel组的Bax、Cyt-c、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达高于Wild-Ni+Mel组,Bcl-2含量较Wild-Ni+Mel组显著降低(p<0.01)。综上所述,镍暴露会造成小鼠肾脏损伤,造成氧化应激导致线粒体凋亡,而敲除Txnrd3后小鼠的氧化应激进一步加剧,凋亡情况进一步加深,而褪黑素可以缓解这种损伤。我们的结果揭示了Txnrd3对小鼠肾脏具有拮抗重金属的作用,敲除Txnrd3后镍暴露导致的损伤会进一步加剧,而褪黑素拮抗重金属的功能在敲除Txnrd3后受到了抑制,作用减弱,在敲除Txnrd3后褪黑素对镍暴露诱导的损伤的治疗效果明显弱于野生型小鼠。这为后续研究Txnrd3对生物体的作用奠定了基础。